羊胎盤免疫活性小分子肽的分離純化.pdf

1、胎盤是哺乳類胎生動物在妊娠時(shí)為胎兒供應(yīng)養(yǎng)分，供胚胎生長的特殊器官。其組織細(xì)胞內(nèi)含有豐富的類固醇激素，肽類激素，前列腺素，生長因子，細(xì)胞因子等胎兒生長所需的物質(zhì)成分。自從1943年日本京都醫(yī)院山島教授從羊胎盤中成功地提取出羊胎素后，對羊胎盤提取液的研究引起了廣大學(xué)者的濃厚興趣。近年來研究發(fā)現(xiàn)，羊胎盤提取液中富含包括小分子肽類的多種生物活性物質(zhì)。但是對羊胎盤提取液中功能組分的純化、功能組分的組成研究的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究采用組織勻漿、反復(fù)凍

2、融、冷凍離心、超濾的方法制備羊胎盤提取液；采用加脲的Tricine-SDS-PAGE電泳初步鑒定胎盤肽的存在；采用RP-HPLC逐級分離、純化羊胎盤提取液肽組分，并采用E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測各肽組分的免疫活性；用Edman降解法測活性組分N末端氨基酸序列。其目的是通過超濾和反相高效液相色譜將結(jié)合的方法分離純化出有免疫活性的胎盤肽，并對所純化的羊胎盤肽的免疫活性進(jìn)行分析和氨基酸序列鑒定，為進(jìn)一步闡明其生物活性的作用機(jī)理和免疫活性小分子肽的進(jìn)

3、一步研發(fā)提供必要的依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容如下：1、采用組織勻漿、反復(fù)凍融和超濾相結(jié)合的方法制備羊胎盤提取液。2、對所制備的羊胎盤提取液進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定，并采用Tricine-SDS-PAGE電泳方法鑒定羊胎盤肽是否存在。3、采用RP-HPLC方法對所制備的羊胎盤提取液逐一純化得到純度比較高的單一組分，并采用E-玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)對各個純化物進(jìn)行免疫活性檢測。4、對免疫活性高且純度較高的組分，采用Edman降解法測定N端氨基酸序

4、列。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、羊胎盤提取液均為無色或微黃色的透明液體，冷凍干燥后呈疏松多孔的海綿狀白色粉末，其PH為6.40±0.02，蛋白質(zhì)定性反應(yīng)檢測中顏色均變成紫紅色，沉淀反應(yīng)中蛋白質(zhì)反應(yīng)呈陰性，電泳結(jié)果顯示羊胎盤提取液中含有小分子肽類物質(zhì)，多肽含量為2.14±0.05mg/ml，在190-340nm范圍內(nèi)分別在212nm和253nm附近有兩個吸收峰。2、RP-HPLC純化出3個純度較高的組分，分別為峰1-5、峰1-7、峰2-

5、3，其純度分別達(dá)到90.6％、91.4％、99.6％。3、通過E-玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)對3個純度較高組分的活性測定表明峰1-5、峰2-3有免疫活性。Edman降解法測得峰2-3的N端的前10個氨基酸序列為：Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe，將該段氨基酸序列登錄美國國立生物技術(shù)信息中心，應(yīng)用BLAST檢索工具進(jìn)行短序列匹配的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)沒有與此多肽同源的序列，為一新的多肽。該多肽的免疫功能穩(wěn)

6、定性及其作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。
　　 結(jié)論：
　　 (1)采用反復(fù)凍融結(jié)合超濾方法獲得PH6.40±0.02、多肽含量為2.14±0.05mg/ml羊胎盤提取液。
　　 (2)利用RP-HPLC逐級分離純化羊胎盤提取液，純化峰1-5、峰1-7、峰2-3三個肽組分，其肽純度分別為90.6％、91.4％、99.6％。E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)峰1-5、峰2-3組分具有增強(qiáng)脫受體的淋巴細(xì)胞恢復(fù)其表面受體的功能，促進(jìn)