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文檔簡介
1、核磁共振(NMR)方法作為一種無損傷檢測方法正越來越廣泛地應用于活細胞、組織器官,乃至整體動物和人體中復雜小分子化合物的體內(nèi)變化研究,這種全新的無損傷方法也用來測定生物細胞內(nèi)游離鎂離子的濃度、細胞內(nèi)pH值并取得了一定的進展。核磁共振測定生物細胞內(nèi)游離鎂離子的方法近年來多應用于臨床醫(yī)學、生物分析等方面。NMR方法可以無損傷地對細胞內(nèi)游離Mg2+濃度進行測定,同時可以考察細胞的代謝情況,允許在較長時間內(nèi)連續(xù)進行觀察。核磁共振方法研究Mg2+
2、一般有兩種方法:31pNMR和19FNMR。目前31pNMR應用比較廣泛,在研究Mg2+的同時可以對含磷代謝物等其它生理指標進行考察,還可以測定細胞內(nèi)的pH,而且所研究的對象范圍很廣,包括離體器官、灌流心臟、懸浮細胞、貼壁細胞及血小板等。本文采用31pNMR對cos-7細胞、兔血小板和人血小板等樣品進行了分析測定,并合成了19FNMR測定鎂離子的指示劑5F-APTRA。本論文共包括4章。 第1章綜述了利用核磁共振方法來考察生物細
3、胞內(nèi)含磷小分子代謝物以及游離鎂離子濃度的研究現(xiàn)狀。 第2章采用31PNMR方法考察了貼壁細胞、血小板的含磷代謝物以及細胞內(nèi)pH。將培養(yǎng)的貼壁細胞cos-7在對數(shù)生長期進行收集,離心稀釋成濃度大于108細胞/mL的細胞懸液,裝進核磁共振管進行31pNMR的測定。然后對所得譜圖進行分析,根據(jù)無機磷(Pi)的化學位移的變化測定細胞內(nèi)的pH。兔血小板由抽取新鮮的兔血經(jīng)離心得到,人血小板由醫(yī)院提供。將兩者分別進行31pNMR的測定,考察了
4、其中含磷代謝物及其pH值。測得cos-7細胞和兔血小板的無機磷化學位移分別為4.69±0.06(n=3)和4.64±0.05(n=3),pH分別為5.58±0.04和5.39±0.02。 第3章建立了31pNMR測定鎂離子的方法,ATP與細胞內(nèi)游離的鎂離子結合,通過利用測量ATP中磷的α和β峰的化學位移差值,能精確確定MgATP和整個ATP的比值,而不需要在細胞樣品與對照組中加入內(nèi)標來確定化學位移。根據(jù)模擬細胞內(nèi)離子強度和酸度等
5、條件下MgATP的解離常數(shù)KDMgATP,能計算出游離鎂離子的濃度。 第4章建立了19FNMR測定鎂離子的方法并進行了5F-APTRA指示劑的合成:原料2,4-二氟硝基苯經(jīng)過與氫氧化鉀反應生成5-氟-2-硝基酚,然后催化氫化生成5-氟-2-氨基酚,再與溴乙酸甲酯在質(zhì)子吸收劑作用下酯化,得到5F-APTRA指示劑。對合成5F-APTRA指示劑的原料及所需試劑進行了合成:5-氟-2-硝基酚,質(zhì)子吸收劑1,8-二(二甲氨基)萘,乙酸溴
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