利用催化發(fā)夾組裝的生物傳感器檢測目標DNA和人源性α-凝血酶.pdf

1、目的：
　　腫瘤相關DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中，與正常DNA相比，其往往會發(fā)生堿基突變，而檢測目標DNA的堿基突變有助于腫瘤的篩查和腫瘤遠處轉移的檢測。由于腫瘤早期體液中的腫瘤DNA表達量很少，因此，尋找一種靈敏、特異的識別方法用于檢測目標DNA的濃度對早期診斷腫瘤有著非常重要的意義。
　　α-凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，它主要參與血液凝血過程，有促凝和抗凝的雙重作用，其在體內的異常表達與血栓性疾病的發(fā)生

2、直接相關。然而，目前用于α-凝血酶的檢測方法卻存在操作繁瑣、試劑價格昂貴、不夠靈敏等問題。
　　本研究利用串聯的分支整合DNA耦合催化發(fā)夾組裝反應（CHA）制成的生物傳感器可直接檢測目標DNA以及人源性α-凝血酶，同時，對傳感器的可行性、靈敏度和特異性進行了分析。
　　方法：
　　1．串聯體分支整合DNA的形成：目標物分子存在的條件下，打開第一條DNA發(fā)夾H1，H1暴露出能打開發(fā)夾H2的序列并打開發(fā)夾H2，H2暴露出的

3、序列打開發(fā)夾H1進入下一個循環(huán)，最終形成一系列串聯體分支整合DNA。當缺乏目標物時，2種發(fā)夾DNA獨立存在于同一體系中，相互之間不發(fā)生反應。
　　2．CHA反應：串聯體分支整合DNA上含有自由的緊密靠近的觸發(fā)鏈，可觸發(fā)C HA的發(fā)生。由于一個目標物分子可引發(fā)一條串聯分支整合DNA鏈形成，而一條分支整合DNA鏈含有多個觸發(fā)鏈，從而觸發(fā)多個C HA反應，實現第一次信號放大。
　　3．類過氧化物酶催化底物反應和信號進一步放大：CH

4、A發(fā)生后，每一條雙鏈 DNA產物末端都含有 G-四聚體結構，當加入血紅素后，G-四聚體被激活并具有類過氧化物酶的活性。在過氧化氫存在下，其催化ABTS發(fā)生氧化還原反應，從而在418 nm處形成特征性吸收峰。
　　4．可行性分析：利用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外可見分光光度計表征可行性。
　　5．傳感器檢測的條件優(yōu)化及性能評價：對 H1與目標DNA之間互補堿基的長度、H2與H3濃度、CHA的孵育時間和孵育溫度進行優(yōu)化；對傳感

5、器的靈敏度、特異性進行評價。
　　結果：
　　1．非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明，分步的串聯體分支整合DNA反應以及 CHA反應可行。紫外可見分光光度計進一步證明目標物分子引發(fā)串聯體分支整合DNA反應，進而由串聯體上的引發(fā)物鏈引發(fā)CHA的一體化反應可行。
　　2．目標物分子加入后觸發(fā)信號放大反應體系，產生的具有類過氧化物酶活性的G-四聚體DNAzyme催化底物并在418 nm處產生特征性吸收峰，根據吸收峰強度隨濃度的

6、變化制定了標準曲線。
　　3．基于串聯體分支整合 DNA及 CHA的傳感器性能：檢測目標DNA分子的線性范圍是1.0 pM到75 nM，檢測下限為0.14 pM（S/N=3）；檢測人源性α-凝血酶的線性范圍是1.0 pM到2.5 nM,檢測下限為0.68 pM（S/N=3）；具有單堿基突變識別能力。
　　結論：
　　本實驗研究利用串聯體分支整合DNA及CHA構建了一種新的生物傳感器檢測目標DNA分子以及人源性α-凝血酶