熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的研究及其在均相免疫分析中的應(yīng)用.pdf

1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種通過熒光物質(zhì)之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析的分子發(fā)射光譜分析法。FRET 作為一種微小距離的“光學(xué)尺”，近年來在蛋白質(zhì)、核酸結(jié)構(gòu)功能檢測、配體-受體相互作用測定等方面的研究工作發(fā)展迅速。關(guān)于FRET的研究工作主要集中在蛋白質(zhì)、核酸結(jié)構(gòu)及其相互作用的研究上，而在生物分析特別是免疫分析方面的研究相對較少?，F(xiàn)階段將FRET 應(yīng)用于免疫分析方面的研究在供受體之間連接臂、供受體偶聯(lián)物的標(biāo)記比以及供受體的配對等方面

2、未有深入研究。本論文對多個FRET 體系在均相競爭免疫分析中的應(yīng)用進(jìn)行深入研究，為基于FRET的均相免疫分析提供了新思路，主要研究結(jié)果如下：
　　 1)首先，分別研究了二抗F(ab')2-QDs/小鼠IgG-RBITC、小鼠IgG-FITC/二抗-TRITC和小鼠IgG-FITC/二抗-Dylight 549 三個FRET 體系用于均相競爭免疫分析的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在連接臂的選擇上，二抗F(ab')2-小鼠IgG和二抗-小

3、鼠IgG這兩種連接臂均滿足FRET 發(fā)生的條件，F(xiàn)RET 現(xiàn)象明顯。在供受體對的選擇上，QDs與RBITC、FITC 與TRITC是比較好的配對，F(xiàn)RET 信號與競爭物濃度變化的關(guān)系較明顯。通過以上研究工作，驗(yàn)證了FRET 用于均相競爭免疫分析的可能性。
　　 2)為縮短供受體之間的距離以提高FRET 效率，以SA-biotin 作為供受體連接臂，對SA-FITC/biotin-Dylight 549的FRET 體系用于均相競爭

4、免疫分析進(jìn)行了研究。
　　 在研究中發(fā)現(xiàn)生物素對SA-FITC的熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)作用，熒光增強(qiáng)約3～4倍，將其與FRET 結(jié)合有利于提高分析方法的靈敏度。研究結(jié)果表明，F(xiàn)ITC 與Dylight 549是一對理想的FRET能量供受體，在FRET 過程中能同時觀測到供體和受體的熒光強(qiáng)度變化；與抗原-抗體連接臂相比，BAS 連接臂能縮短供受體之間的距離，F(xiàn)RET 過程更為明顯。在此研究基礎(chǔ)上，建立了基于熒光增強(qiáng)FRET的檢測生物素的均

5、相競爭分析方法，該方法操作簡便，耗時短，反應(yīng)時間只需15分鐘；最低檢測限可達(dá)0.5nM；線性范圍寬（0.8～9.8nM），可用于實(shí)際樣品（如牛奶）中生物素的檢測。
　　 3)研究了偶聯(lián)物的F/P值（熒光染料和蛋白質(zhì)的摩爾比）對FRET 效率的影響。
　　 將稀土螯合物BHHCT-Eu3+作為能量供體，Dylight 649 作為為能量受體，羊抗小鼠IgG-小鼠IgG的免疫復(fù)合物為連接臂（BHHCT-Eu3+標(biāo)記羊抗小鼠I

6、gG，Dylight 649標(biāo)記小鼠IgG）研究F/P值對于FRET 應(yīng)用于免疫分析的影響。結(jié)果表明，只有當(dāng)F/P值適中（F/P值在10 左右）時才能得到高的FRET 效率，F(xiàn)/P值過低使得供受體熒光團(tuán)之間的平均距離變大導(dǎo)致FRET 效率降低，而F/P值過高（大于20）會影響抗體與抗原結(jié)合的活性而致使FRET 效率降低。
　　 4)以稀土螯合物BHHCT-Eu3+作為能量供體標(biāo)記AFP 抗原，Dylight 649 作為能量受體

7、標(biāo)記AFP 單抗，建立了一種基于時間分辨FRET的均相免疫分析檢測甲胎蛋白的方法。該方法操作簡便，耗時較短（反應(yīng)時間約30分鐘），且其線性范圍較寬（0.05～2 μg/mL），可用于AFP 抗原的初篩。
　　 本論文通過對多個FRET 體系在均相競爭免疫分析中的應(yīng)用進(jìn)行深入研究，包括不同能量供受體對（傳統(tǒng)有機(jī)染料、量子點(diǎn)、鑭系元素）及不同連接臂的FRET體系（抗原抗體體系、生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)），探討了FRET 供受體對及供受