量子點熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的建立及其均相免疫檢測黃曲霉毒素B1的研究.pdf

1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence eesonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)為實現(xiàn)感應(yīng)納米尺度的距離變化提供了快速、靈敏并且簡單的檢測手段。傳統(tǒng)FRET體系，常利用熒光蛋白和有機(jī)染料作為熒光探針，但由于熒光基團(tuán)吸收光譜范圍窄，發(fā)射光譜常伴隨拖尾現(xiàn)象，容易造成供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜相互干擾，重疊程度受到影響，導(dǎo)致FRET效率降低。同時傳統(tǒng)熒光物質(zhì)的抗光漂白及化學(xué)穩(wěn)定性較差，在應(yīng)用過程中易發(fā)生光降解

2、和化學(xué)降解，也使得FRET的應(yīng)用受到限制。
　　量子點作為一種新型的熒光材料，具有激發(fā)光譜范圍寬、發(fā)射光譜窄且可調(diào)諧、抗光漂白及光穩(wěn)定性好等獨特的光學(xué)特性。基于量子點FRET原理構(gòu)建的檢測新方法在免疫分析、生物分子的相互作用及生物傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用近年來取得了很大進(jìn)展。然而，在以上的FRET體系中，量子點常被用來作為能量轉(zhuǎn)移的供體，而利用兩種不同發(fā)射波長的量子點作為供、受體的研究報道并不多見。量子點具有高于傳統(tǒng)有機(jī)染料一個數(shù)量級的

3、光子吸收截面，因此理論上，量子點可作為一種優(yōu)良的能量受體應(yīng)用于FRET體系。
　　黃曲霉毒素B1（AFB1）是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的次級代謝產(chǎn)物，是一種具有劇毒、致突變、致畸、致癌的化合物。食用受AFB1污染的食品對人體健康具有極大的危害，建立簡便、快速、靈敏的AFB1特異性分析方法對于防控AFB1污染具有重要意義，而基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光免疫分析方法作為一種新型的檢測方法備受關(guān)注。
　　本研究利用兩種不同尺寸直徑的量子

4、點，分別與AFB1及抗體進(jìn)行偶聯(lián)，利用抗原-抗體之間的特異性親和反應(yīng)，使供體和受體量子點滿足發(fā)生FRET的距離，并進(jìn)一步考察了供受體偶聯(lián)物不同標(biāo)記比率對FRET效率的影響，在此基礎(chǔ)上建立了AFB1均相競爭免疫新方法，并應(yīng)用于大米提取液中AFB1的定量檢測。
　　具體研究過程如下：
　　首先，采用綠色量子點（QSA530）偶聯(lián) AFB1作為能量供體，紅色量子點（QSH620）偶聯(lián)抗AFB1抗體作為受體。采用DCC/NHS制備不

5、同AFB1投料比的綠色量子點偶聯(lián)物；采用EDC/NHSS法制備不同抗AFB1抗體投料比的紅色量子點偶聯(lián)物。瓊脂糖凝膠電泳及紅外圖譜等方法進(jìn)行偶聯(lián)效果的表征，結(jié)果表明偶聯(lián)后的量子點熒光強(qiáng)度略有降低（6％–8%），但最大發(fā)射波長未發(fā)生偏移。探討了供受體偶聯(lián)物抗原抗體標(biāo)記比率對FRET效率的影響，結(jié)果表明在多個“單價”受體結(jié)合單個“多價”供體的反應(yīng)模式下，兩種量子點間能夠產(chǎn)生合理且持續(xù)增強(qiáng)的共振能量轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步通過正交試驗優(yōu)化獲得最佳QSA5

6、30:AFB1標(biāo)記比率為1:10，mAb:QSH620標(biāo)記比率為1:1，最佳供體/受體反應(yīng)配比定為5.0。
　　其次，考察了反應(yīng)溶液中pH值、離子強(qiáng)度、甲醇含量以及反應(yīng)時間對FRET效率的影響，實驗結(jié)果表明反應(yīng)體系的pH值、離子強(qiáng)度及有機(jī)溶劑含量對FRET效率影響較大，該變化不僅來源于環(huán)境條件對免疫學(xué)效率的影響，同時來源于對量子點之間的能量傳遞影響。通過條件優(yōu)化，本研究確定pH7.4，含10mM NaCl和10%甲醇（v/v）的P

7、B緩沖液作為FRET反應(yīng)工作液，檢測時間為加樣后20min。以大米提取液為基質(zhì)的FRET定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-4.065Ln(x)+12.142（R2=0.9904），AFB1定量范圍為0.06–5.0ng/mL，大米提取液中AFB1最低檢測靈敏度為0.04ng/mL。特異性實驗結(jié)果表明，該反應(yīng)與其他結(jié)構(gòu)類似物及真菌毒素交叉反應(yīng)率較低；加標(biāo)回收實驗結(jié)果表明，大米樣品平均加標(biāo)回收率介于81.28%–97.36%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在3.9