RNA二級結(jié)構(gòu)在果蠅Dscam基因外顯子4和6互斥可變剪接中的作用研究.pdf

1、RNA可變剪接是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，可極大的增加蛋白質(zhì)的多樣性與生物體的復(fù)雜性，RNA的互斥可變剪接是其中一種最復(fù)雜的類型，它的機(jī)制目前尚無定論。RNA互斥可變剪接即在基因轉(zhuǎn)錄生成的前體mRNA中，一組可變剪接外顯子（兩個及以上）連續(xù)排列在一起，但在成熟的mRNA中只有其中的一個成員能被選擇剪接保留下來。RNA互斥可變剪接很早就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但直至目前，科研人員對互斥可變剪接的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。模式生物黑腹果蠅（D.m

2、elanogaster）Dscam基因是互斥可變剪接研究中最著名的基因，該基因含有四組互斥外顯子，可以通過互斥可變剪接形成38016種不同的異構(gòu)體。盡管RNA互斥可變剪調(diào)控機(jī)制存在多種假說，并且科學(xué)家Gravely在2005年通過生物信息學(xué)方法提出了錨定位點-選擇序列模型，解釋了其中一組互斥外顯子的調(diào)控模型，然而，這個機(jī)制沒有在其它的的互斥外顯子剪接中發(fā)現(xiàn)，不能很好的解釋該基因如何巧妙的產(chǎn)生如此多的可變剪接形式。
　　本研究利用生

3、物信息學(xué)方法深入分析果蠅20個物種Dscam基因的4號互斥可變外顯子序列。分析結(jié)果顯示，在可變外顯子4相關(guān)的內(nèi)含子中存在一些保守的序列元件，類似于Gravely所提出的錨定位點-選擇序列剪接機(jī)制模型，選擇序列位于每個互斥外顯子后面的內(nèi)含子中，錨定位點位于最后面的內(nèi)含子中，選擇序列和錨定位點反向互補(bǔ)形成莖環(huán)狀的二級結(jié)構(gòu)，選擇序列競爭配對錨定位點從而指導(dǎo)外顯子4的互斥可變剪接。不同果蠅物種的這些保守選擇序列和錨定位點形成的二級結(jié)構(gòu)具有驚人的

4、保守性，提示這些序列保守的元件很可能指導(dǎo)并左右著互斥外顯子4的可變剪接情況。隨后開展的一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炑芯繑?shù)據(jù)證實了我們對這些特定序列功能的猜想。此外，利用生物信息學(xué)手段我們發(fā)現(xiàn)，在20個果蠅物種的Dscam基因外顯子6的錨定位點前面存在一段復(fù)雜的內(nèi)含子序列，它可以形成六個串聯(lián)排列的緊湊RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且該相似的RNA二級結(jié)構(gòu)在其它昆蟲物種中具有較好的進(jìn)化保守性。我們由此推測這段內(nèi)含子序列是調(diào)控果蠅Dscam基因外顯子6互斥可變剪接的

5、重要元件。在此科學(xué)設(shè)想的基礎(chǔ)上，我們利用果蠅永生化S2細(xì)胞株對Dscam基因表達(dá)展開了一些實驗研究:通過破壞、互補(bǔ)突變、插入、刪除部分保守序列等手段我們檢測了該基因互斥外顯子6的可變剪接情況。所有的實驗結(jié)果分析表明:這段可形成六個莖環(huán)狀的RNA配對結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子序列參與了果蠅Dscam基因外顯子6的各互斥外顯子的可變剪接，該保守RNA二級結(jié)構(gòu)在互斥可變剪接中起到了極重要的調(diào)控作用。
　　本研究利用EMSA實驗技術(shù)對果蠅14-3-3ζ

6、基因的互斥可變外顯子序列、與其內(nèi)含子序列以及果蠅Dscam外顯子6前面的類增強(qiáng)子莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列與RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示互斥外顯子序列傾向于結(jié)合SR蛋白、其內(nèi)含子序列傾向于結(jié)合hnRNP蛋白、類增強(qiáng)子序列傾向于結(jié)合SR蛋白。這些實驗數(shù)據(jù)說明除了RNA形成的特殊二級結(jié)構(gòu)，一些RNA剪接蛋白可與RNA的序列元件特異結(jié)合共同參與RNA互斥可變外顯子的可變剪接，后續(xù)實驗仍在進(jìn)行中。綜上所述，我們對RNA二級結(jié)構(gòu)在模式生物果蠅D