Shewanella oneidensis鞭毛絲亞基蛋白的翻譯后修飾及FlaA和FlaB功能差異研究.pdf

1、在翻譯結(jié)束之后，許多蛋白必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棽啪哂衅渖飳W(xué)功能，糖基修飾是其中最普遍的一種方式，尤其對鞭毛絲亞基蛋白而言。在許多致病菌株中，鞭毛絲亞基蛋白的糖基化修飾已經(jīng)得到了很好的研究。但是關(guān)于Shewanella oneidensis這類蛋白的糖基修飾還未見報道。S.oneidensis的運(yùn)動依賴于由兩種鞭毛絲亞基蛋白亞基FlaA和FlaB組裝而成的單極性鞭毛。盡管FlaA和FlaB的氨基酸序列非常保守，但二者在功能上存在顯著差別:F

2、laB為主要功能的鞭毛絲亞基蛋白而FlaA功能極其有限。在本論文中，我們利用nanoLC-MS/MS及一系列的生物技術(shù)，系統(tǒng)研究了FlaB鞭毛絲亞基蛋白的翻譯后修飾，確定了與功能直接相關(guān)的氨基酸殘基，并分析了造成FlaA和FlaB功能差異的主要原因，取得了以下結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建了適合在不影響功能前提下過量表達(dá)鞭毛絲亞基蛋白的遺傳體系;利用該系統(tǒng)表達(dá)、提取和純化了具主要功能的FlaB;利用nanoLC-MS和nanoLC-MS

3、/MS分析了用胰蛋白酶消化形成的多肽。2.結(jié)合半胱氨酸突變掃描技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)了S.oneidensisFlaB鞭毛絲亞基蛋白的五個絲氨酸殘基被O-linked糖基修飾，并且在同一位點(diǎn)修飾糖基的分子量經(jīng)常存在14Da的差異。這說明翻譯后修飾的糖由兩部分組成:一部分是分子量恒定的糖基(274Da)，另一部分是分子量以14Da為差異單位可變的糖基，該14Da為差異單位推測為甲基。3.FlaB中大量的賴氨酸被甲基修飾。通過研究確定了S.onei

4、densis的甲基轉(zhuǎn)移酶為FliB(SO4160)，是與Salmonella enterica serovar Typhimurium甲基轉(zhuǎn)移酶同源的蛋白。
　　 4.為了解開S.oneidensis序列高度相似的兩個鞭毛絲亞基蛋白FlaA和FlaB的巨大功能差異之謎，系統(tǒng)分析了這兩個蛋白的編碼基因啟動子、T3SS蛋白分泌指導(dǎo)序列、鞭毛絲亞基蛋白三維結(jié)構(gòu)及兩個蛋白可變區(qū)內(nèi)的不同氨基酸等對其功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)FlaA和FlaB盡

5、管在啟動子活性和蛋白分泌方面存在一定不同，但這些不足以解釋其功能上的巨大差異。與之相反，在蛋白序列和結(jié)構(gòu)上的些微區(qū)別卻決定了FlaA和FlaB的顯著不同生物學(xué)作用。在第三個α-螺旋(α3)的C-端和Loop3鏈接區(qū)的氨基酸決定了FlaB為主要功能的鞭毛絲亞基蛋白，其中FlaB的T129位點(diǎn)和T134位點(diǎn)為關(guān)鍵的氨基酸。Shewanella的Loop4是可變區(qū)中保守性最高的區(qū)域，用丙氨酸突變掃描FlaB中Loop4的保守氨基酸，三個位點(diǎn)的