糖原合酶激酶3對蛋白磷酸酯酶2A催化亞基翻譯及翻譯后修飾水平的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文糖原合酶激酶3對蛋白磷酸酯酶2A催化亞基翻譯及翻譯后修飾水平的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究姓名：姚秀卿申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：王建枝20110525華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文2將選用小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞株N2a和人胚腎細(xì)胞株HEK293，給予磷脂酰肌醇3激酶抑制劑wtmannin（WO，1μM和2μM，間接激活GSK3）或GSK3的特異性拮抗劑SB216763（SB，5μM和7μM）

2、或WO和SB聯(lián)合給藥；或轉(zhuǎn)染野生型GSK3β質(zhì)粒、蛋白磷酸酯酶1B（PTP1B）或蛋白酪氨酸激酶SrcRNA干擾質(zhì)粒、PP2A甲酯酶（PME1）或PP2A甲基轉(zhuǎn)移酶（PPMT1）RNA干擾質(zhì)粒；或在整體水平，通過在SpragueDawley大鼠腦立體定位注射10μl的100μMWO或70μM的SB或100μMWO與70μMSB聯(lián)合給藥；或C57BL6小鼠海馬腦立體定位注射2μl表達(dá)野生型GSK3β的慢病毒；還選用了GSK3β基因敲除的雜

3、合子小鼠(GSK3βmice)為研究對象。采用免疫印跡方法（Westernblotting）檢測以上各樣品中PP2AC、pY307PP2AC水平，dmL309PP2AC水平，PTP1B、Src、CREB、PME1、PPMT1及PP2A調(diào)節(jié)亞基（PP2AB）的蛋白水平。免疫組織化學(xué)的方法檢測了表達(dá)GSK3β慢病毒后小鼠海馬pY307PP2AC、dmL309PP2AC和總PP2AC的變化。免疫共沉淀的方法檢測了PTP1B、Src、PME1、

4、PPMT1與GSK3β的相互作用。ELISA方法檢測總的蛋白酪氨酸磷酸酯酶的酶活性以及PTP1B和Src的酶活性。RTPCR方法檢測了PP2AC、PTP1B、PME1和PPMT1的mRNA水平。【結(jié)果】【結(jié)果】當(dāng)給予PI3K抑制劑WO處理后，pS9GSK3β水平下降；PP2AC蛋白水平降低；pY307、Src蛋白水平增加、PTP1B蛋白水平下降，PTP1B的酶活性降低；dmL309、PME1蛋白水平增加，而PPMT1蛋白水平下降；PP2

5、AB蛋白水平降低。而當(dāng)給予GSK3的特異性拮抗劑SB處理后，pS9GSK3β水平上升；PP2AC蛋白表達(dá)水平增加；pY307、Src蛋白水平降低、PTP1B蛋白水平增加，PTP1B的酶活性增加；dmL309、PME1蛋白水平降低，PPMT1蛋白水平增加；PP2AB蛋白水平升高。且SB能逆轉(zhuǎn)WO誘導(dǎo)的上述各指標(biāo)的變化。而WO或SB處理對Src的活性沒有明顯的改變。過表達(dá)GSK3β野生型質(zhì)粒后，PP2AC水平下降；pY307、Src水平升高