安絲菌素生物合成的后修飾研究.pdf

1、本文從基因失活、突變體次生代謝產(chǎn)物的分析、基因異源表達(dá)、重組蛋白催化特性幾方面對安絲菌素后修飾酶Asm25(酰胺N-糖基轉(zhuǎn)移酶)和Asm12(氯代酶)的功能進(jìn)行了研究。同時還從云南美登木(Maytenus hookeri)的內(nèi)生放線菌CS中克隆到了一個FADH2依賴型鹵化酶并對其體外催化特性進(jìn)行了研究。
　　 通過基因敲除的方法得到糖基轉(zhuǎn)移酶基因asm25的失活質(zhì)粒，利用接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入野生型菌株替換野生型的基因得到了突變體。采用L

2、C-ESI-MS分析突變體的產(chǎn)物，對累積的主產(chǎn)物進(jìn)行分離，并通過MS(質(zhì)譜)和NMR(核磁共振)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。突變體產(chǎn)物分析結(jié)果表明，asm25失活后產(chǎn)生了N-去甲基安絲菌素(NDMP-3，N-demethyl-AP-3；NDMP-2，N-demethyl-AP-2)。Asm25基因失活突變體與N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因asm10失活的突變體累積相同的主產(chǎn)物NDMP-3，表明酰胺N-甲基化和酰胺N-糖基化是安絲菌素和安絲菌素酰胺N-苷生物

3、合成途徑的分枝步驟。通過asm25基因的回補得到回補突變體pJTU813/asm25-5，對其產(chǎn)物進(jìn)行LC-ESI-MS檢測，結(jié)果表明基因回補后恢復(fù)了其產(chǎn)生安絲菌素酰胺N-苷的能力。
　　 Asm12是安絲菌素生物合成途徑中編碼鹵代酶的基因，通過基因失活證明了它的功能是催化proansmitocin C-19的氯取代反應(yīng)?？寺sm12基因到pET32a+中，在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)plysS成功表達(dá)了C端帶有

4、His標(biāo)簽的可溶性蛋白。通過MS和NMR來檢測無細(xì)胞提取物及純酶的體外催化活性，結(jié)果證明異源表達(dá)的Asm12能轉(zhuǎn)化proansmitocin生成19-chloroproansmitocin，但是不能催化L- tryptophan進(jìn)行氯取代。酶體外催化活性的研究結(jié)果也表明，Asm12是FADH2依賴型的鹵化酶。以proansmitocin為底物對Asm12的酶促動力學(xué)進(jìn)行了研究，測定了其米氏常數(shù)為4.163μM。
　　 云南美登木

5、的內(nèi)生菌CS產(chǎn)生化合物naphthomycin A，其結(jié)構(gòu)中含一個氯原子，根據(jù)FADH2-依賴型鹵化酶的保守區(qū)設(shè)計簡并引物從CS的基因組DNA中擴(kuò)增到了鹵代酶的基因片段cshaloA，以該基因片段作探針通過克隆雜交篩選，從CS基因組文庫中得到了cshaloA的全長基因。該基因與已經(jīng)鑒定功能的asm12具有95％的同源性，推斷的氨基酸序列含有FADH2依賴型鹵化酶的兩個保守區(qū)?？寺shaloA全長基因到pET32a+在大腸桿菌E.col

6、i BL21(DE3)中成功表達(dá)了C端帶有His標(biāo)簽的可溶性蛋白，通過Ni親和層析得到純酶進(jìn)行體外酶活性檢測。以proansmitocin為底物，異源表達(dá)的CshaloA可以催化其氯取代反應(yīng)，但是需要FADH2為輔因子。體外酶活性檢測證明Csha1oA和Asm12的催化特性相似，都是FADH2依賴型的鹵化酶，L-tryptophan不能作為它們的底物。
　　 本文的研究結(jié)果為選擇性分離安絲菌素的衍生物提供了新的思路，另外酰胺N-