Shewanella oneidensis對氨芐青霉素抗性的分子機制研究.pdf

1、Shewanella oneidensis是屬于γ-變形菌綱的兼性厭氧菌，具有還原多種有機物和無機物的能力?；诖?，目前S.oneidensis已成為研究環(huán)境污染物的氧化還原及其分子機制的模式菌株。同樣被人熟知的是，該菌對氨芐青霉素具有天然抗性。然而，我們在研究中意外發(fā)現(xiàn)S.oneidensis對氨芐青霉素的反應(yīng)獨特:中濃度（0.49～6.25μg/mL）比高濃度的氨芐青霉素對生長的抑制效果更好。為了找出該現(xiàn)象的科學(xué)解釋，本文對S.on

2、eidensis產(chǎn)生氨芐青霉素抗性的分子機制進(jìn)行了研究，其結(jié)果如下:S.oneidensisβ-內(nèi)酰胺酶BIaA的表達(dá)水平與氨芐青霉素引發(fā)的細(xì)胞裂解相關(guān)
　　 利用形成于氣液界面的生物被膜形成體系和抗生素敏感性試驗檢測了S.oneidensis對β-內(nèi)酰胺類抗生素的響應(yīng)。研究表明，只有當(dāng)氨芐青霉素濃度范圍在0.49～6.25μg/mL時，S.oneidensis生物被膜的形成才會推遲。通過檢測該菌在氨芐青霉素中的生長，發(fā)現(xiàn)低濃度

3、抗生素引發(fā)的細(xì)胞裂解導(dǎo)致了生物被膜形成的延遲。盡管S.oneidensis基因組中含有7個可能編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，但基因突變分析表明該菌對氨芐青霉素產(chǎn)生抗性只與其中一個β-內(nèi)酰胺酶相關(guān):BlaA。高濃度氨芐青霉素能有效誘導(dǎo)BlaA的表達(dá)，而低濃度抗生素?zé)o此能力，顯示其引發(fā)的細(xì)胞裂解很大程度上是由于BlaA表達(dá)量不足。研究結(jié)果還表明，細(xì)菌中含量最多的低分子量青霉素結(jié)合蛋白PBP5在細(xì)菌對抗氨芐青霉素時發(fā)揮重要作用。PBP5除作為β-內(nèi)

4、酰胺類抗生素的“陷阱”外，還可能通過未知的信號途徑調(diào)控BlaA的表達(dá)。
　　 金屬離子對S.oneidensis氨芐青零素抗性的影響
　　 EDTA加劇由低濃度氨芐青霉素引發(fā)的細(xì)胞裂解，而大多數(shù)金屬離子對細(xì)胞裂解具有緩和作用。利用抗生素敏感性實驗發(fā)現(xiàn)金屬離子能增強細(xì)菌對氨芐青霉素的抗性，尤以Zn2+的效果最為顯著。Zn2+對細(xì)菌抗性的增強作用依賴于β-內(nèi)酰胺酶BIaA的產(chǎn)生，但并非通過增強金屬β-內(nèi)酰胺酶活性和提高bla

5、A基因表達(dá)量來實現(xiàn)。更為可能的機制是，金屬離子降低了細(xì)胞外膜通透性致使抗生素難以進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間，盡管外膜孔蛋白SO0312和SO3060的缺失并不影響Zn2+對細(xì)菌抗性的增強作用。此外，金屬離子還能影響細(xì)菌對其它多種抗生素的敏感性。S.oneidensis blaA基因表達(dá)的調(diào)控
　　 通過比較不同突變株中blaA基因啟動子PblaA的活性和對氨芐青霉素的敏感性發(fā)現(xiàn)，BlaA表達(dá)的調(diào)控與已經(jīng)系統(tǒng)研究的β-內(nèi)酰胺酶AmpC（Ci

6、trobacterfreundii）的表達(dá)調(diào)控顯著不同，但二者都與肽聚糖循環(huán)密切相關(guān)。與AmpC的表達(dá)調(diào)控正相反，S.oneidensis中通透酶AmpG的失活引起B(yǎng)laA表達(dá)顯著提高，使細(xì)菌對氨芐青霉素產(chǎn)生超強抗性。為了找出影響blaA表達(dá)的基因，構(gòu)建了可以直接通過觀察菌落顏色反映細(xì)胞中BlaA表達(dá)水平的菌株WT/P blaA-lacZ。以WT/P blaA-lacZ菌株為親本，利用轉(zhuǎn)座子隨機突變技術(shù)篩選獲得了9個blaA表達(dá)顯著增強

7、的突變株。經(jīng)轉(zhuǎn)座位點確定和序列比對分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子插入位點主要集中于mrcA和忉C。mrcA和lppC分別編碼高分子量青霉素結(jié)合蛋白PBP1a和外膜脂蛋白LppC，其中LppC與Escherichia coli的PBP1a伴侶蛋白LpoA具有很高的同源性。S.oneidensis中LppC很有可能與PBP1a形成復(fù)合體參與肽聚糖的合成?；诩?xì)胞不能同時缺失PBP1a-LpoA和PBP1b-LpoB，通過構(gòu)建合成致死突變株，編碼S.one

8、idensis的PBP1b-LpoB的基因被確定。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S.oneidensis的PBP1a-LpoA和PBP1b-LpoB復(fù)合體的功能具有明顯差異:PBP1a-LpoA復(fù)合體與細(xì)菌正常生長有關(guān)，更重要的是，這個復(fù)合體的缺失引起B(yǎng)laA組成型高表達(dá)，使細(xì)菌對氨芐青霉素產(chǎn)生超強抗性;而PBP1b-LpoB復(fù)合體對細(xì)菌生長和氨芐青霉素抗性都沒有影響。此外，由mrcA缺失引起的BlaA高表達(dá)與通透酶AmpG無關(guān)，表明誘導(dǎo)blaA表達(dá)