乳桿菌的有氧代謝與枯草芽孢桿菌益生作用機制研究.pdf

1、盡管乳酸菌的分類是基于它們厭氧或者微好氧條件下代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸的能力，許多乳酸菌都可以在有氧條件下生長代謝并利用乳酸。乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于典型的乳酸菌，由于其風味特性、益生特性、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力及發(fā)酵過程中的易用性，常被用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的生產(chǎn)中。乳酸桿菌在有氧條件下的生理代謝各不相同，如何充分利用有氧生長獲取高密度的菌體細胞并通過降低氧脅迫保持較高的細胞活性，對于其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的

2、意義。
　　 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，在動物日糧中添加B.subtilis可以明顯增加胃腸道和糞便中乳桿菌的數(shù)量，但其機理還沒有得到充分解釋。
　　 因此，本文以植物乳桿菌(Lb.plantarum)、短小乳桿菌(Lb.brevis)為對象，對其有氧代謝進行了研究，同時以B.subtilis168為對象，基于乳桿菌的有氧代謝對其益生作用機制進行探討，另外

3、還對乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑的工藝創(chuàng)新進行了初步探索，具體結(jié)果如下:
　　 1.Lb.plantarum的發(fā)酵、有氧代謝與氧脅迫
　　 Lb.plantarum是一種廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的菌株。本文研究了Lb.plantarum LA1在MRS（0.5％葡萄糖）培養(yǎng)基中、以下四種條件下:
　　 ①厭氧條件（靜止培養(yǎng)）;
　　 ②有氧條件（搖動培養(yǎng)）;
　　

4、③有氧呼吸條件（搖動培養(yǎng)+外源血紅素和維生素K2，即將其電子傳遞鏈補充完整）;
　　 ④過氧化氫酶保護條件（搖動培養(yǎng)+外源血紅素，即激活其自身過氧化氫酶）下的代謝特性，包括:
　　 ①生物量(OD600);
　　 ②細胞活力(CFU/mL);
　　 ③葡萄糖代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸、乙醇）;
　　 ④氧脅迫（培養(yǎng)基中H2O2含量）。
　　 氧氣參與Lb.plantarum LA1的代謝時對其具

5、有明顯的兩面性。有氧代謝可使其最高菌體密度從3.5提高至5.0左右，但同時會產(chǎn)生高達3-4 mM的H2O2，因此達到生長峰值后細胞因嚴重的氧脅迫迅速開始死亡，24小時以后幾乎不能檢測到活菌。Lb.plantarum發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸，而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔?，并且在添加血紅素激活其自身過氧化氫酶后，高活力細胞可將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸，同時產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。目前關(guān)于Lb.plantarum有氧呼吸的

6、研究并不充分，本文的結(jié)果說明，有氧呼吸可以進一步促進Lb.plantarum的有氧代謝，但對生物量的提高作用并不明顯，與其它有氧條件并無顯著差異。
　　 2.Lb.brevis的發(fā)酵與有氧代謝研究
　　 Lb.brevis作為一種重要的發(fā)酵劑，常用于切達干酪的生產(chǎn)，在干酪的成熟中起著重要作用。本文研究了Lb.brevis ATCC367在上述四種條件下的代謝特性。氧氣參與Lb.brevis的代謝時對其具有顯著的益處，既使

7、其生物量從1.5提高至4.1（搖動條件）甚至5.5（有氧呼吸），又檢測不到H2O2的積累，因此可保持較高的細胞活力。Lb.brevis發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸，同時伴有CO2和少量乙醇的生成，而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔?，并最終將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸，同時產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。Lb.brevis的有氧呼吸未見報道，本文的結(jié)果說明，有氧呼吸可以顯著促進Lb.brevis的有氧代謝，使其比其他三種條件下具有更迅速的

8、代謝轉(zhuǎn)化和更高的生物量。
　　 3.Lb.brevis有氧代謝時乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化途徑
　　 在Lb.plantarum和Lb.brevis的有氧代謝中均存在乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。目前對Lb.plantarum的這一轉(zhuǎn)化途徑研究比較清楚，即乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶和乙酸激酶途徑，并由丙酮酸氧化酶產(chǎn)生對細胞有毒性的H2O2。但Lb.brevis在乙酸生成中并無H2O2積累，其具體途徑未見報道。本研究通過單交換法構(gòu)建了Lb.bre

9、vis ATCC367的丙酮酸脫氫酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pdh和丙酮酸氧化酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pox，其發(fā)酵代謝與野生型并無明顯差異。但是在有氧代謝時，丙酮酸脫氫酶缺陷株的生物量較野生型出現(xiàn)大幅下降，終產(chǎn)物中乳酸增加、乙酸減少，且無乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸氧化酶缺陷株的有氧代謝與野生型無異。由此證明了丙酮酸脫氫酶在Lb.brevis有氧代謝中的主導(dǎo)作用。另外，real time RT-PCR

10、顯示，在搖動條件下尤其是葡萄糖耗盡時丙酮酸脫氫酶基因pdh和丙酮酸氧化酶基因pox的表達出現(xiàn)顯著上調(diào)，證明了氧氣對二者的正調(diào)控和葡萄糖對二者的負調(diào)控作用。由此，本文闡明了Lb.brevis在有氧代謝時伴隨額外ATP產(chǎn)生的乳酸乙酸轉(zhuǎn)化途徑，從而為其高密度發(fā)酵和抗氧脅迫提供了理論依據(jù)。
　　 4.B.subtilis協(xié)助乳桿菌對抗氧脅迫
　　 B.subtilis作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，傳統(tǒng)觀點認為其通過“

11、生物奪氧”機制為腸道中另一種益生菌——乳酸桿菌創(chuàng)造有利環(huán)境而促進其生長。但是腸道中動態(tài)變化的氧氣水平不可避免會地影響乳桿菌的代謝，且一些乳桿菌可在利用氧氣獲得更高生物量的同時產(chǎn)生細胞毒性的H2O2。本文檢測了B.subtilis在人工腸液中的自裂解現(xiàn)象，并通過HPLC檢測驗證了其裂解液中含有血紅素。將B.subtilis168與Lb.plantarum LA1進行體外搖動混合培養(yǎng)2天后，Lb.plantarum的細胞存活力較單獨通氧培養(yǎng)

12、提高了109倍;或?qū).subtilis的裂解液添加到培養(yǎng)基中，Lb.plantarum自身過氧化氫酶被激活，可維持較高細胞存活力、較高DNA完整度，且培養(yǎng)物中無H2O2積累。因此，乳桿菌可得益于B.subtilis活菌產(chǎn)生的過氧化氫酶和裂解后產(chǎn)生的血紅素，從而對抗氧脅迫。本研究對B.subtilis現(xiàn)有的益生作用機理進行了進一步補充。
　　 5.乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑工藝創(chuàng)新初探
　　 液態(tài)混合型

13、微生態(tài)制劑的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是將乳桿菌和B.subtilis分別培養(yǎng)后再混合。一些乳桿菌在通氧培養(yǎng)條件下可獲得更高的生物量，但同時會因遭受氧脅迫(如H2O2)而降低細胞存活力;B.subtilis是一種好氧菌，對抗氧脅迫的機制較為完善，它可產(chǎn)生乳桿菌不具有的血紅素和過氧化氫酶。因此二者的混合培養(yǎng)具有許多優(yōu)勢。為在終培養(yǎng)物中達到高菌體蛋白、高乳桿菌活菌數(shù)和高芽孢數(shù)，本文通過對接種狀態(tài)、接種量和接種比例進行優(yōu)化，確定了在MRS（0.5％葡萄糖）