鹽度脅迫對三疣梭子蟹體內(nèi)游離氨基酸代謝通路影響的研究.pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(Portunus)，是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類。海洋水生甲殼動物主要依靠兩種不同的滲透壓調(diào)節(jié)機制，即非等滲細胞外調(diào)節(jié)（AER）和等滲細胞內(nèi)調(diào)節(jié)（IIR）。IIR主要是通過Na+-K+-泵調(diào)節(jié)機體無機離子的含量，而IIR主要借助于游離氨

2、基酸(free amino acids，F(xiàn)AAs)含量的變化從而調(diào)節(jié)機體的滲透壓，相比AER調(diào)節(jié)方式，F(xiàn)AAs有利于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　本研究分為三個部分：第一部分：鹽度脅迫對三疣梭子蟹鰓，肌肉，血淋巴中游離氨基酸（Free amino acids， FAAs）含量變化的影響。結果顯示：肌肉中含量最高，其次為鰓，血淋巴含量最低。三個組織中總游離氨基酸（total free amino acid，TOFAA）的含量與外界鹽度

3、呈正相關（P<0.05），發(fā)揮滲透壓調(diào)節(jié)作用的FAAs主要為Ala，Glu，Gly，Pro。Pro在高鹽環(huán)境滲透壓調(diào)節(jié)方面均表現(xiàn)出主導作用，因此，研究Pro的代謝通路對梭子蟹高鹽適應有重要意義。第二部分：鹽度脅迫對三疣梭子蟹谷氨酸脫氫酶(Glu dehydrogenase，GDH)的基因表達以及酶活性影響的分析。該部分主要驗證GDH作為Pro代謝通路的上游關鍵酶，對Pro含量的調(diào)控作用。Real-Time PCR和酶活結果分析顯示：高鹽

4、促進了GDH的表達，但活性受到顯著地抑制。因此結果表明Pro的合成主要受到自身代謝通路的調(diào)控，而非簡單的由GDH的控制。第三部分：鹽度脅迫對三疣梭子蟹Pro三條代謝通路中三個關鍵基因的分子水平和蛋白水平變化的研究。首先，對 Ornithine途徑中的鳥氨酸氨基轉移酶(Ornithine aminotransferase，OAT)的分析。采用RACE方法獲得OAT的cDNA全長為1754bp，其中開放閱讀框1317bp，編碼438個氨基酸

5、。同源性分析表明與捕食螨(Metaseiulus occidentalis)的OAT氨基酸序列同源性最高，Real-Time PCR和酶活結果顯示：高鹽和低鹽顯著抑制了OAT的表達和酶的活性。因此本實驗表明，OAT對鹽度變化較敏感，Ornithine途徑可能不是梭子蟹鹽度脅迫下合成Pro的主要途徑。其次，對另一條合成途徑Glu途徑中Δ1-吡咯林-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，

6、P5CS)分析。Real-Time PCR和酶活結果顯示：鹽度對P5CS的表達沒有顯著地影響，但是酶活性變化與外界鹽度表現(xiàn)正相關性（P<0.01）。因此，結果表明鹽度脅迫下P5CS在合成Pro起主要作用，Glu途徑為合成 Pro的主要合成途徑。最后，探究 Pro唯一一條分解途徑中的關鍵基因-脯氨酸脫氫酶(Proline dehydrogenase，ProH)對鹽度變化的適應情況。采用 RACE方法獲得三疣梭子蟹ProH的cDNA全長為2