三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)鹽度調(diào)控相關(guān)基因的篩選.pdf

1、三疣梭子蟹，隸屬于甲殼綱、十足目、梭子蟹科，梭子蟹屬，具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高等特點，是中國沿海的重要經(jīng)濟蟹類。它是一種廣鹽性蟹類，對鹽度有一定的適應(yīng)范圍，不同的鹽度條件將影響三疣梭子蟹種群的分布和洄游。由于過度捕撈，梭子蟹自然資源正日益減少。近年來，我國沿海已廣泛開展了三疣梭子蟹的人工養(yǎng)殖，它已經(jīng)成為我國最重要的養(yǎng)殖海產(chǎn)蟹。鹽度是三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖過程中的一個重要的因素。關(guān)于廣鹽性蟹類的滲透調(diào)控機理已有部分研究，在分子水平上的研

2、究較少。從分子水平上弄清三疣梭子蟹的滲透調(diào)控機理對三疣梭子蟹種質(zhì)資源的改良和人工養(yǎng)殖具有重要意義。篩選獲得滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因是其必要的前提。
　　 本研究以三疣梭子蟹鰓組織為材料，構(gòu)建其全長cDNA文庫。從該文庫隨機挑選5012個單克隆進行測序，共獲得高質(zhì)量的ESTs序列4433個，平均長度為748bp。經(jīng)過CAP3組裝后獲得2426個假定轉(zhuǎn)錄本(重疊群238個，單拷貝2188個)。每個重疊群中EST的數(shù)量在2～641個，平均為1

3、0.34個。所有轉(zhuǎn)錄本經(jīng)Blastx在NCBI的非冗余蛋白庫進行比較分析發(fā)現(xiàn)，有858條ESTs可以找到其同源序列(E-value<10-4)。
　　 最初的注釋結(jié)果表明：1.7％的ESTs為蛋白酶，5.2％的ESTs為核糖體蛋白，6.9％的ESTs為線粒體轉(zhuǎn)錄子。相似的序列用物種進行分類，我們發(fā)現(xiàn)：果蠅(20.05％)，小鼠(8.51％)，大鼠(8.04％)，人(7.58％)，爪蟾(3.96％)和斑馬魚(3.96％)。轉(zhuǎn)錄子的

4、注釋結(jié)果顯示，在4433個EST中有629個單拷貝，占所以NEST的14.2％；通過GeneOntology的生物功能分類發(fā)現(xiàn)有292個單拷貝序列可能與鹽度調(diào)控有關(guān)，占整個單拷貝的1296。這些候選基因大致可進一步劃分為7個功能類別：抗氧化活性(5.4％)，轉(zhuǎn)運蛋白(15.8％)，脅迫相關(guān)蛋白(11.0％)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(13.7％)，蛋白合成(22.4％)，轉(zhuǎn)錄(13.7％)以及新陳代謝與能量代謝(17.5％)。
　　 利用T3，

5、T7通用引物，通過PCR擴增獲得2426個uni基因。純化后的PCR擴增產(chǎn)物送至博奧生物有限公司，用于cDNA芯片制備。每個PCR產(chǎn)物在芯片上重復(fù)三次。分別提取10‰、25‰、40‰三組樣本各3只蟹的總RNA，分別命名為：G-10、G-25與G-40。我們一共雜交4張芯片：將G-10與G-25雜交，并且進行cy3與cy5熒光交換；另外，將G-40與G-25雜交，并且進行cy3與cy5熒光交換，從而分別獲得低鹽/高鹽與對照條件下差異表達的

6、基因。
　　 通過cDNA芯片雜交我們一共篩選獲得了417個顯著差異表達的基因。利用cluster3.0來分析來進行不同鹽度條件下，差異表達基因的聚類分析，結(jié)果顯示：這些差異表達的基因可以分成8個cluster，每個Cluster具有不同的基因表達模式。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：低鹽條件下(10‰養(yǎng)殖水體)，158個基因的表達量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，54個基因的表達量呈顯著下調(diào)；高鹽條件下(40‰養(yǎng)殖水體)，123個基因的表達量顯著上調(diào)，222個基因的