代謝型谷氨酸受體組成性活性突變體的構(gòu)建和功能檢測.pdf

1、L-谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性突觸神經(jīng)遞質(zhì),通過與谷氨酸受體(glutamate receptor,GluR)結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)功能。在哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞中存在兩類谷氨酸受體,離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體,其中代謝型谷氨酸受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起調(diào)節(jié)突觸傳遞和神經(jīng)元興奮性作用,廣泛參與學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等多種生理病理過程。mGluR在體內(nèi)受到非常精密的調(diào)控,其過度激活或抑制都會引起各種神

2、經(jīng)性疾病,因此,研究mGluR的組成性激活并篩選出mGluR組成性活性突變體為進(jìn)一步的GPCR激活機(jī)制研究、調(diào)控和藥物篩選創(chuàng)造了條件。
　　本研究基于mGluR的半胱氨酸富集區(qū)(cysteine rich domain,CRD)與該受體的激活有直接聯(lián)系,研究證實(shí),mGluR的CRD區(qū)存在的四對二硫鍵是該受體VFT區(qū)和HD區(qū)之間變構(gòu)偶聯(lián)所必須的,同時mGluR2二聚體CRD區(qū)半胱氨酸形成的二硫鍵斷裂或重新生成可導(dǎo)致受體的組成性激活。

3、本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測其它亞型mGluR的二硫鍵分布,在其它亞型mGluR的CRD區(qū)引入突變位點(diǎn)得到14個突變體,通過分子生物學(xué)檢驗(yàn),本研究構(gòu)建的14個mGluR突變體均能夠正確表達(dá)。同時,ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除mGluR1C524A外,其它13個mGluR突變體均能夠在細(xì)胞膜上表達(dá)。在IP3功能檢測中,沒有配體(Glutamate)結(jié)合的mGluR4C502A等10個突變體的IP3積累量和激活后的野生型mGluR的IP3積累量相

4、差不明顯。
　　本研究結(jié)果顯示,mGluR4、mGluR5、mGluR6、mGluR7、mGluR8與mGluR2的CRD區(qū)具有類似的結(jié)構(gòu)和激活機(jī)制,mGluR1的CRD區(qū)雖然在序列上和其他亞型非常接近,但其結(jié)構(gòu)和功能存在較大差異。mGluR4C502A、mGluR4H523C、mGluR5C512A、mGluR5T533C、mGluR6C512A、mGluR6H533C、mGluR7C523A、mGluR7T544C、mGluR