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文檔簡(jiǎn)介
1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸是最重要的神經(jīng)遞質(zhì),在體內(nèi)谷氨酸受體可分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體(Metabotropic Glutamate Receptors,mGluRs)兩種。代謝型谷氨酸受體屬于C族G蛋白偶聯(lián)受體,參與神經(jīng)信號(hào)傳遞,學(xué)習(xí)和記憶等多種生理進(jìn)程。多種神經(jīng)退行性疾病,比如神經(jīng)分裂癥、阿爾茲海默癥、帕金森癥和多重硬化癥等的病理發(fā)生也與mGluRs的功能密切相關(guān)。
代謝型谷氨酸受體與B型γ-氨基丁酸受體(GAB
2、A-B receptor,GABABR)、鈣敏感性受體(Calcium Sensing Receptor,CaSR)、味覺(jué)受體第一家族(Taste Receptor Family1 member,T1R)等均屬于C族G蛋白偶聯(lián)受體(G-Protein Coupling Receptors,GPCRs)。該族受體除具有G蛋白偶聯(lián)受體所共有的跨膜的與G蛋白偶聯(lián)的七螺旋跨膜結(jié)構(gòu)(Heptahelical Transmembrane Domai
3、n,HD)和胞內(nèi)結(jié)合多種信號(hào)蛋白不同長(zhǎng)度的C-tail之外,還具有復(fù)雜的胞外結(jié)構(gòu)域(Extracellular Domain,ECD)。其中mGluRs受體的ECD包含結(jié)合配體的捕蠅草結(jié)構(gòu)域(VenusFly Trap Domain,VFT)與連接VFT和HD之間的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(Cysteine Rich Domain,CRD)。
同時(shí)該族受體發(fā)生組成性的二聚化。在早期研究中一般認(rèn)為mGluRs和CaSR形成同源二聚體,
4、而GABABR和T1R形成異源二聚體。但2011年研究者發(fā)現(xiàn)特定亞族的mGluRs之間也可以在體外發(fā)生異源二聚化并形成具有功能的異源二聚體。2014年研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)mGluR2與 mGluR4之間形成的異源二聚體mGluR2/4在神經(jīng)元中存在并可被相應(yīng)藥物激活。但目前研究者對(duì)mGluR2/4異源二聚體的激活性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還存在矛盾之處。在Paul J.Kammermeier的研究中發(fā)現(xiàn)該異源二聚體的激活需要其兩個(gè)單體的ECD均結(jié)合配體
5、,而在Shen Yin的研究中發(fā)現(xiàn)只需一個(gè)單體的VFT結(jié)合配體即可導(dǎo)致該異源二聚體的激活。
需要指出的是,上述兩項(xiàng)研究均是在共表達(dá)mGluR2與mGluR4兩種受體的情況下得出的結(jié)論,因此無(wú)法回避mGluR2同源二聚體與mGluR4同源二聚體的干擾。更早的研究發(fā)現(xiàn)GABABR的兩個(gè)單體GB1和GB2亞基具有不同的C-tail,單獨(dú)表達(dá)GB1并不能到達(dá)細(xì)胞膜,只有與GB2共表達(dá)時(shí)通過(guò)GB1-C-tail和GB2-C-tail之間
6、的相互作用從而在細(xì)胞膜上形成嚴(yán)格的異源二聚體。通過(guò)將改良的GB1-C-tail和GB2-C-tail引入到mGluR2中,可以在同時(shí)表達(dá)兩種帶有不同C-tail的mGluR2融合受體時(shí),只有發(fā)生了異源二聚化的mGluR2才能正常表達(dá)在細(xì)胞膜上。此外研究者發(fā)現(xiàn),通過(guò)將熒光基團(tuán)引入到mGluR2的VFT頂部,表達(dá)mGluR2熒光融合受體并予以激動(dòng)劑刺激,可以檢測(cè)到在受體的激活過(guò)程中,其頂部熒光基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescen
7、ce Resonance Energy Transfer,FRET)信號(hào)降低,說(shuō)明激活過(guò)程中mGluR2同源二聚體的ECDs中兩個(gè)VFT頂部之間的距離變遠(yuǎn)。
因此,在本研究中我們利用GABABR的特性,構(gòu)建帶有不同的C-tail的mGluR2與mGluR4融合受體,并在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)不同的融合受體組合,以期在細(xì)胞膜表面形成嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體。進(jìn)一步利用mGluRs的天然配體谷氨酸(Glutamate)、
8、mGluR2的特異性激動(dòng)劑DCG-IV((2S,2’R,3’R)-2-(2’,3'-dicarboxycy clopropyl) glycine)和mGluR4的特異性激動(dòng)劑L-AP4(l-(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid)對(duì)表達(dá)上述嚴(yán)格異源二聚體的細(xì)胞進(jìn)行刺激,并檢測(cè)其藥理學(xué)反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCG-IV和L-AP4單獨(dú)刺激時(shí)均可以激活該異源二聚體,說(shuō)明該異源二聚體的激活只需要一個(gè)單體的VFT結(jié)合配體
9、,但DCG-IV和L-AP4合并刺激或Glutamate刺激時(shí)可獲得更強(qiáng)的激活強(qiáng)度。隨之我們進(jìn)一步構(gòu)建了帶有Snap熒光基團(tuán)和不同C-tail的mGluR2和mGluR4融合受體,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)檢測(cè)了不同激動(dòng)劑作用下mGluR2/4異源二聚體的ECDs的構(gòu)象變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCG-IV和L-4單獨(dú)刺激時(shí)均可導(dǎo)致ECDs中兩個(gè)VFT之間的FRET信號(hào)發(fā)生一定幅度的降低,而DCG-IV和L-AP4合并刺激或Glutamate刺激時(shí)FRET信號(hào)
10、發(fā)生更大幅度的降低。
總的來(lái)說(shuō),本研究的結(jié)果首先證實(shí)可以在體外表達(dá)系統(tǒng)中形成嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體,從而為該受體的后續(xù)研究建立良好的體外研究模型。同時(shí)證明嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體只需一個(gè)單體的VFT結(jié)合配體就可會(huì)導(dǎo)致該受體的激活,但兩個(gè)單體的VFT同時(shí)結(jié)合配體可更強(qiáng)的激活配體,從而解決了之前關(guān)于該受體的不同研究結(jié)果之間的爭(zhēng)議。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)該受體至少存在兩種不同激活強(qiáng)度的激活態(tài),而不同的激活狀態(tài)與ECDs中V
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