代謝型谷氨酸受體2-4(mGluR2-4)胞外區(qū)構(gòu)象的初步研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸是最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)谷氨酸受體可分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體(Metabotropic Glutamate Receptors,mGluRs)兩種。代謝型谷氨酸受體屬于C族G蛋白偶聯(lián)受體，參與神經(jīng)信號傳遞，學(xué)習(xí)和記憶等多種生理進(jìn)程。多種神經(jīng)退行性疾病，比如神經(jīng)分裂癥、阿爾茲海默癥、帕金森癥和多重硬化癥等的病理發(fā)生也與mGluRs的功能密切相關(guān)。
　　代謝型谷氨酸受體與B型γ-氨基丁酸受體(GAB

2、A-B receptor,GABABR)、鈣敏感性受體（Calcium Sensing Receptor,CaSR)、味覺受體第一家族(Taste Receptor Family1 member,T1R)等均屬于C族G蛋白偶聯(lián)受體（G-Protein Coupling Receptors，GPCRs）。該族受體除具有G蛋白偶聯(lián)受體所共有的跨膜的與G蛋白偶聯(lián)的七螺旋跨膜結(jié)構(gòu)（Heptahelical Transmembrane Domai

3、n，HD）和胞內(nèi)結(jié)合多種信號蛋白不同長度的C-tail之外，還具有復(fù)雜的胞外結(jié)構(gòu)域（Extracellular Domain，ECD）。其中mGluRs受體的ECD包含結(jié)合配體的捕蠅草結(jié)構(gòu)域（VenusFly Trap Domain,VFT）與連接VFT和HD之間的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域（Cysteine Rich Domain,CRD）。
　　同時該族受體發(fā)生組成性的二聚化。在早期研究中一般認(rèn)為mGluRs和CaSR形成同源二聚體，

4、而GABABR和T1R形成異源二聚體。但2011年研究者發(fā)現(xiàn)特定亞族的mGluRs之間也可以在體外發(fā)生異源二聚化并形成具有功能的異源二聚體。2014年研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)mGluR2與 mGluR4之間形成的異源二聚體mGluR2/4在神經(jīng)元中存在并可被相應(yīng)藥物激活。但目前研究者對mGluR2/4異源二聚體的激活性質(zhì)的實驗結(jié)果還存在矛盾之處。在Paul J.Kammermeier的研究中發(fā)現(xiàn)該異源二聚體的激活需要其兩個單體的ECD均結(jié)合配體

5、，而在Shen Yin的研究中發(fā)現(xiàn)只需一個單體的VFT結(jié)合配體即可導(dǎo)致該異源二聚體的激活。
　　需要指出的是，上述兩項研究均是在共表達(dá)mGluR2與mGluR4兩種受體的情況下得出的結(jié)論，因此無法回避mGluR2同源二聚體與mGluR4同源二聚體的干擾。更早的研究發(fā)現(xiàn)GABABR的兩個單體GB1和GB2亞基具有不同的C-tail，單獨表達(dá)GB1并不能到達(dá)細(xì)胞膜，只有與GB2共表達(dá)時通過GB1-C-tail和GB2-C-tail之間

6、的相互作用從而在細(xì)胞膜上形成嚴(yán)格的異源二聚體。通過將改良的GB1-C-tail和GB2-C-tail引入到mGluR2中，可以在同時表達(dá)兩種帶有不同C-tail的mGluR2融合受體時，只有發(fā)生了異源二聚化的mGluR2才能正常表達(dá)在細(xì)胞膜上。此外研究者發(fā)現(xiàn)，通過將熒光基團(tuán)引入到mGluR2的VFT頂部，表達(dá)mGluR2熒光融合受體并予以激動劑刺激，可以檢測到在受體的激活過程中，其頂部熒光基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescen

7、ce Resonance Energy Transfer,FRET）信號降低，說明激活過程中mGluR2同源二聚體的ECDs中兩個VFT頂部之間的距離變遠(yuǎn)。
　　因此，在本研究中我們利用GABABR的特性，構(gòu)建帶有不同的C-tail的mGluR2與mGluR4融合受體，并在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)不同的融合受體組合，以期在細(xì)胞膜表面形成嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體。進(jìn)一步利用mGluRs的天然配體谷氨酸(Glutamate)、

8、mGluR2的特異性激動劑DCG-IV((2S,2’R,3’R)-2-(2’,3'-dicarboxycy clopropyl) glycine)和mGluR4的特異性激動劑L-AP4(l-(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid)對表達(dá)上述嚴(yán)格異源二聚體的細(xì)胞進(jìn)行刺激，并檢測其藥理學(xué)反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCG-IV和L-AP4單獨刺激時均可以激活該異源二聚體，說明該異源二聚體的激活只需要一個單體的VFT結(jié)合配體

9、，但DCG-IV和L-AP4合并刺激或Glutamate刺激時可獲得更強的激活強度。隨之我們進(jìn)一步構(gòu)建了帶有Snap熒光基團(tuán)和不同C-tail的mGluR2和mGluR4融合受體，并根據(jù)實驗設(shè)計檢測了不同激動劑作用下mGluR2/4異源二聚體的ECDs的構(gòu)象變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCG-IV和L-4單獨刺激時均可導(dǎo)致ECDs中兩個VFT之間的FRET信號發(fā)生一定幅度的降低，而DCG-IV和L-AP4合并刺激或Glutamate刺激時FRET信號

10、發(fā)生更大幅度的降低。
　　總的來說，本研究的結(jié)果首先證實可以在體外表達(dá)系統(tǒng)中形成嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體，從而為該受體的后續(xù)研究建立良好的體外研究模型。同時證明嚴(yán)格的mGluR2/4異源二聚體只需一個單體的VFT結(jié)合配體就可會導(dǎo)致該受體的激活，但兩個單體的VFT同時結(jié)合配體可更強的激活配體，從而解決了之前關(guān)于該受體的不同研究結(jié)果之間的爭議。同時我們還發(fā)現(xiàn)該受體至少存在兩種不同激活強度的激活態(tài)，而不同的激活狀態(tài)與ECDs中V