文昌魚AmphiSox7-like基因在內(nèi)胚層發(fā)育中的研究.pdf

1、文昌魚的進(jìn)化地位處于脊索動物的基部，因其身體圖式的基本特征與脊椎動物相似，而成為研究脊椎動物起源和進(jìn)化的重要材料。脊椎動物的轉(zhuǎn)錄因子Sox7和Sox17在內(nèi)胚層表達(dá)，在早期胚胎發(fā)育及內(nèi)胚層形成過程中起著重要的作用。對斑馬魚、爪蛙等生物的Sox7及Sox17研究發(fā)現(xiàn)，它們都可以誘導(dǎo)泛內(nèi)胚層標(biāo)記基因Edd的表達(dá)，是內(nèi)胚層形成必不可少的。文昌魚是否存在和脊椎動物Sox7、Sox17類似的基因，以及它們是否參與內(nèi)胚層發(fā)育尚不清楚。
　　

2、 本研究在青島文昌魚基因組中只找到一個脊椎動物Sox7和Sox17的同源基因，并克隆了其完整的編碼序列，其完整的開放閱讀框長度為1824 bp，編碼一個含有607個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白同其他物種中的Sox家族成員一樣含有一個HMG-box，而且在碳端含有Sox-C-TAD的特征，說明它是Sox基因家族的一員。盡管在青島文昌魚基因組中只發(fā)現(xiàn)一個脊椎動物Sox7和Sox17的同源基因，但用2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹都表明，文昌魚的該Sox家

3、族成員與脊椎動物的Sox7聚為一支，顯示它與Sox7的進(jìn)化關(guān)系更近，因此我們將該基因命名為AmphiSox7-like。AmphiSox7-like與多種生物的Sox7有較高的序列保守性，提示了AmphiSox7-like在進(jìn)化過程中功能的保守性和重要性。
　　 Real-Time PCR結(jié)果顯示，文昌魚AmphiSox7-like基因存在母源性表達(dá)，到3h囊胚期母源性的表達(dá)因消耗而降低。在合子基因表達(dá)以后，隨著發(fā)育進(jìn)行，到6h

4、，AmphiSox7-like的表達(dá)量持續(xù)增大，在9h左右的晚原腸胚表達(dá)量最大，隨后開始下降。在48 h幼魚階段，AmphiSox7-like僅剩很低水平的表達(dá)。同時，文昌魚胚胎原位雜交結(jié)果也證明AmphiSox7-like存在母源性表達(dá)，而且揭示了AmphiSox7-like在囊胚時期呈不對稱性表達(dá)，植物半球的表達(dá)量高于動物半球。原腸胚時期，該基因在原腸胚內(nèi)層即預(yù)定中內(nèi)胚層細(xì)胞中表達(dá)。該表達(dá)圖式說明文昌魚AmphiSox7-like可

5、能與中內(nèi)胚層的發(fā)育有關(guān)。
　　 為了研究青島文昌魚AmphiSox7-like的功能，我們構(gòu)建了ASox7（即AmphiSox7-like）、DSox7和DSox17(即斑馬魚Sox7和Sox17)的pCS2+表達(dá)載體，并通過體外轉(zhuǎn)錄得到其mRNA。應(yīng)用顯微注射技術(shù)分別將上述3個基因的mRNA注射到斑馬魚一細(xì)胞期的胚胎中，對AmphiSox7-like的功能進(jìn)行了跨物種的研究。這3個基因的過表達(dá)導(dǎo)致了相似的異常表型，如無眼、單眼

6、、小眼、小頭、體軸彎曲、心包囊腫等。用Real-Time PCR和原位雜交技術(shù)檢測AmphiSox7-like過表達(dá)胚胎中各胚層標(biāo)記基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，內(nèi)胚層標(biāo)記基因Sox32的表達(dá)上調(diào)，中胚層標(biāo)記基因ntl和外胚層標(biāo)記基因otx2的表達(dá)下調(diào)。據(jù)此可以推斷，像文獻(xiàn)早已報道的DSox7和DSox17—樣，AmphiSox7-like也參與內(nèi)胚層的發(fā)育.它促進(jìn)內(nèi)胚層形成，并可能因此導(dǎo)致中胚層和外胚層受到抑制，從而導(dǎo)致上述異常表型。分別注射

7、斑馬魚DSox17-MO或DSox7-MO敲低斑馬魚的DSox7或DSox17,并共注射不同劑量的文昌魚AmphiSox7-like mRNA以拯救其表型。結(jié)果顯示AmphiSox7-like mRNA可以糾正注射MO所造成的表型缺陷，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。這些結(jié)果表明，AmphiSox7-like與DSox7和DSox17的功能在一定程度上存在著重疊，對內(nèi)胚層的發(fā)育有促進(jìn)作用。這也與系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果相符，即文昌魚只有一個Sox7/ S