黑曲霉脂肪酶A在畢赤酵母細(xì)胞表面的展示研究.pdf

1、黑曲霉被美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)認(rèn)定為GRAS生物,其產(chǎn)生的脂肪酶催化水解或合成甘油三酯具有高度的1,3-位置特異性,廣泛應(yīng)用于食品添加劑、油脂改性、手性化合物拆分及清潔添加劑等領(lǐng)域。然而,目前其主要以游離態(tài)形式予以應(yīng)用,在有機(jī)溶劑中易失活,并難以回收重復(fù)利用,生產(chǎn)成本高。針對(duì)游離態(tài)酶在應(yīng)用中的上述缺陷,擬利用微生物表面展示技術(shù)將黑曲霉脂肪酶A(ANLA)展示于酵母細(xì)胞表面,在提高酶穩(wěn)定性的同時(shí),實(shí)現(xiàn)脂肪酶的表達(dá)、固定及純化一體化

2、、簡(jiǎn)單化。同時(shí),考慮到有諸多因素影響著展示脂肪酶的活力,本研究在前期實(shí)驗(yàn)室篩選的釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白Sed1錨定蛋白的基礎(chǔ)上,以畢赤酵母X-33(釀酒酵母存在過(guò)度糖基化現(xiàn)象)為宿主,探討了不同連接序列和啟動(dòng)子對(duì)展示ANLA酶活力的影響,以期為開(kāi)發(fā)性能良好的黑曲霉脂肪酶全細(xì)胞催化劑提供新的理論探討和技術(shù)支持。主要研究工作和結(jié)果摘要如下:
　　1.以酵母細(xì)胞壁蛋白Sed1為錨定蛋白,在Sed1與ANLA之間插入不同的連接序列,構(gòu)建六種基

3、于不同連接序列的表面展示系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)篩選各獲得1株酶活力較高的重組菌株,分別為X-33/pAOX-A0S89＃,X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pAOX-AS1S44＃,X-33/pAOX-AS2S32＃,X-33/pAOX-AS3S42＃,X-33/pAOX-AS4S62＃。采用Fisher法(α=0.05)對(duì)六株重組菌株的酶活力進(jìn)行多重比較,結(jié)果顯示X-33/pAOX-AGS44＃酶活最高,可達(dá)到24.96U/g干細(xì)胞,略

4、大于X-33/pAOX-AS1S44＃酶活(22.74U/g干細(xì)胞),兩者均顯著大于其余四株重組菌株的酶活。利用流式細(xì)胞儀對(duì)六株重組菌株展示效率進(jìn)行檢測(cè)分析,X-33/pAOX-AGS44＃的展示率最高,達(dá)94.58％,而X-33/pAOX-AS1S44＃的展示率最低,僅為61.57%。上述結(jié)果表明,選用(G4S)3為連接序列構(gòu)建的重組菌株X-33/pAOX-AGS44＃展示ANLA的效果最佳。展示ANLA的最適溫度和最適pH分別為45

5、°C,pH7.5,與游離酶一致,但穩(wěn)定性有所提高。
　　2.構(gòu)建誘導(dǎo)型表面展示載體pFLD-AGS和組成型表面展示載體pGAP-AGS,pTEF-AGS,分別將其電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中,經(jīng)篩選各獲得1株酶活力較高的重組菌株,分別為X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃,X-33/pTEF-AGS77＃。對(duì)三株重組菌與之前獲得的X-33/pAOX-AGS44＃酶活力進(jìn)行多重比較分析,結(jié)果表明X-33/p

6、AOX-AGS44＃與X-33/pFLD-AGS35＃之間酶活無(wú)顯著差別,但顯著大于另兩株的酶活,而X-33/pTEF-AGS77＃酶活顯著小于其它三株重組菌株。
　　3.分別對(duì)X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,在甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為72h,初始pH為6.0,每24h甲醇添加量為1%,接種量為6%,裝液量為50mL的條件下,X-33/pAOX-AG

7、S44＃展示ANLA的酶活力最高可達(dá)到38.02U/g干細(xì)胞;在甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為72h,初始pH為7.5,每24h甲醇添加量為2%,接種量為2%,裝液量為40mL的條件下,X-33/pFLD-AGS35＃展示ANLA的酶活力可達(dá)30.46U/g干細(xì)胞;在以油酸作為碳源,氮源蛋白胨及酵母提取物濃度分別為4%,1%,初始pH為6.5,接種量為2%,裝液量為50mL,培養(yǎng)時(shí)間為48h的條件下,X-33/pGAP-AGS19＃展示ANLA的酶活力