畢赤酵母表面展示海藻糖合酶技術(shù)的研究.pdf

1、海藻糖合酶是一種能夠一步法轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的酶制劑，其底物專一性較高，使用該酶生產(chǎn)海藻糖工藝簡(jiǎn)單，不受底物麥芽糖濃度的影響，是工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的首選。
　　為獲得具有生產(chǎn)海藻唐合酶能力的畢赤酵母表面展示載體，以實(shí)驗(yàn)室篩選的惡臭假單胞桿菌Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增得到海澡糖合酶基因(tres,2064 bp),連接至pPICZαA質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-tres。以來自

2、pEGFP-N1質(zhì)粒的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的基因（egfp，720bp）為外源展示蛋白編碼基因，以來源于釀酒酵母的共價(jià)連接酵母細(xì)胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽作為畢赤酵母表面展示的錨定蛋白，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到pir1p(847bp),連接至重組質(zhì)粒pPICZαA-tres中，構(gòu)建成pPICZαA–tres-egfp-pir1p重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pPICZαA–tres-egfp-pir1p利用電轉(zhuǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GS115

3、中,外源蛋白在α-factor信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌表達(dá)并錨定到細(xì)胞壁上，展示在細(xì)胞壁表面。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到熒光強(qiáng)度，說明外源蛋白成功展示到畢赤酵母，并以此為判斷依據(jù)優(yōu)化出外源蛋白表達(dá)量較高的發(fā)酵條件。繼續(xù)將pir1p(847bp)連接至重組質(zhì)粒pPICZαA-tres中，重新構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA–tres-pir1p,轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115,篩選出陽(yáng)性克隆子，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心、破碎并使用昆布多糖酶水解、洗脫，SDS-

4、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析可見明顯融合蛋白條帶，說明海藻糖合酶已成功錨定在畢赤酵母表面。將重組畢赤酵母使用pH7.5的緩沖液清洗并重懸，與底物濃度為300g/L的麥芽糖在30℃-60℃水浴條件下作用2h,反應(yīng)產(chǎn)物藻利用HPLC檢測(cè)，能夠檢測(cè)到海藻糖合酶學(xué)活性300.65U/g。在優(yōu)化后的酶促反應(yīng)條件pH7.5,50℃表面展示海藻糖合酶的酶活達(dá)到600.65U/g。40℃-50℃之間酶活較穩(wěn)定,保溫60min后殘留酶活的相對(duì)活力達(dá)75％以上；