黑曲霉阿魏酸酯酶基因在畢赤酵母及黑曲霉中的高效表達.pdf

1、半纖維素是纖維素外植物細胞壁中含量最豐富的組份。半纖維素中50％的成份是木聚糖。木聚糖骨架的降解依賴兩大類酶：內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶（EC3.2.1.8）可將木聚糖骨架降解成較小的低聚糖，這些低聚糖在β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）的作用下降解成木糖。除了這兩大類酶發(fā)揮主導(dǎo)作用外，其他一些酶類也參與了木聚糖的降解，如阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡萄糖醛酸酶和對香豆酸酯酶，其中阿魏酸酯酶發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2、它能夠水解植物細胞壁大分子之間通過阿魏酸或雙阿魏酸形成的酯鍵，導(dǎo)致植物細胞壁復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，使得其他水解酶更容易接近底物的作用中心。阿魏酸酯酶在飼料、食品、生物能源、化妝和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　基于GenBank數(shù)據(jù)庫黑曲霉（Aspergillus niger）阿魏酸酯酶A的序列設(shè)計引物，以A. niger h408染色體DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，P

3、CR）獲得其阿魏酸酯酶A的全基因。DNA序列分析顯示A. niger faeA（AnfaeA）全基因的長度為903bp，含有兩個外顯子，1個內(nèi)含子。采用重疊延伸PCR技術(shù)成功克隆得到A. niger h408阿魏酸酯酶 A的cDNA基因（GenBank:KF911349）。測序結(jié)果顯示黑曲霉faeA cDNA序列為783bp，含有1個開放閱讀框架（ORF），編碼260個氨基酸。Blast分析顯示該基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序

4、列同一性為99%，翻譯的氨基酸序列含有脂酶典型的活性蓋子和催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。
　　將 AnfaeA基因和畢赤酵母表達載體 pPIC9K連接，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-Anfae，重組表達質(zhì)粒經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，實現(xiàn)了黑曲霉阿魏酸酯酶A基因在P. pastoris GS115中的高效表達。平板透明圈法篩選到5株阿魏酸酯酶活性高的轉(zhuǎn)化子，1株編號為pPIC9K-Anfae5的轉(zhuǎn)化子阿魏

5、酸酯酶活性最高，酶活達24.72U/mL，比活力為40.84U/mg，比黑曲霉出發(fā)菌株（22.1mU/mL）提高了1100倍左右。SDS-PAGE分析顯示重組酶的分子量為33kDa，超出預(yù)期分子量28kDa。重組阿魏酸酯酶性質(zhì)研究表明：其最適pH為5.0，且在pH4-9穩(wěn)定性較好；最適反應(yīng)溫度50℃，在40-50℃時較穩(wěn)定。
　　對重組畢赤酵母 pPIC9K-Anfae5進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，最佳的發(fā)酵條件為：接種量在5%-10%之

6、間；初始生長pH及誘導(dǎo)pH為6.0左右；甲醇誘導(dǎo)濃度為1%，誘導(dǎo)時間為84h。在搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對重組菌進行了50L和500L的發(fā)酵中試實驗，結(jié)果表明：處于對數(shù)初期時即可檢測到阿魏酸酯酶活，隨發(fā)酵的進行酶活迅速升高，當菌體處于平穩(wěn)期（84h）時酶活達到最高，分別為102.1U/mL、121.8U/mL，比搖瓶發(fā)酵的酶活提高了5倍左右。此后隨時間延長，酶活趨于平穩(wěn)，菌體密度開始下降，因此選用84h（甲醇誘導(dǎo)56h）作為發(fā)酵終止點。重

7、組畢赤酵母的中試為該酶的工業(yè)化積累了數(shù)據(jù)和經(jīng)驗。
　　畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性雖高，但是產(chǎn)酶品種單一，體外復(fù)合酶終究不如絲狀真菌本身酶系齊全和比例適當，因此進行了阿魏酸酯酶在黑曲霉出發(fā)菌株中的表達。選用黑曲霉烯醇化酶基因的啟動子（Peno）作為fae表達盒的啟動子，深綠木霉丙酮酸脫酸化酶基因（Tpdc）的終止子作為fae表達盒的終止子，構(gòu)建Peno-fae-Tpdc（PFT）表達盒，與潮霉素抗性質(zhì)粒pAN7-1共轉(zhuǎn)化黑曲霉原

8、生質(zhì)體，實現(xiàn)了AnfaeA在黑曲霉出發(fā)菌株中的組成性表達。經(jīng)抗性復(fù)篩得到19株具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，在阿魏酸乙酯平板上有透明圈的有7株轉(zhuǎn)化子。通過PCR驗證7株轉(zhuǎn)化子的基因組中均已經(jīng)整合了構(gòu)建的PFT表達盒。對7株重組子進行了發(fā)酵實驗，其中一株編號為pft-4的轉(zhuǎn)化子酶活最高，達567.46mU/mL，比相同培養(yǎng)條件下黑曲霉h408發(fā)酵提高了約251倍，尤其是產(chǎn)酶最高峰從第7d縮短至48h。7株轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液酶活高低不一，可能是目的基