簡介：2013－2014學(xué)年第二學(xué)期生物學(xué)實驗教學(xué)安排學(xué)年第二學(xué)期生物學(xué)實驗教學(xué)安排一、課程代碼一、課程代碼07334012二、課程名稱藥物分析實驗二、課程名稱藥物分析實驗三、課程學(xué)時三、課程學(xué)時3232四、課程學(xué)分四、課程學(xué)分1五、人數(shù)五、人數(shù)105105六、年級六、年級20112011七、組數(shù)七、組數(shù)3八、專業(yè)制藥工程、藥物制劑八、專業(yè)制藥工程、藥物制劑九、實驗項目的內(nèi)容及要求九、實驗項目的內(nèi)容及要求序號實驗項目實驗項目項目項目學(xué)時學(xué)時項目項目學(xué)分學(xué)分實驗實驗類型類型實驗實驗要求要求指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師助教研助教研究生究生準(zhǔn)備準(zhǔn)備教師教師組別實驗日期實驗日期實驗時間實驗時間實驗實驗室43月19日星期三1300～153053月20日星期四1300～15301基本技術(shù)培訓(xùn)基本技術(shù)培訓(xùn)0基礎(chǔ)必修權(quán)宇彤周曉雪王靜權(quán)宇彤33月22日星期六1330～1530C44543月26日星期三1300～163033月27日星期四1300～16302藥物一般雜質(zhì)及特殊雜質(zhì)檢查藥物一般雜質(zhì)及特殊雜質(zhì)檢查8024綜合必修王英武楊艷胡良海謝晶周曉雪王靜權(quán)宇彤53月29日星期六830～1130C44544月16日星期三1300～163054月17日星期四1300～16303片劑的溶出度測定片劑的溶出度測定8024綜合必修王英武楊艷胡良海謝晶周曉雪王靜權(quán)宇彤34月19日星期六830～1130C44544月23日星期三1300～163054月24日星期四1300～16304高效液相色譜法測定撲熱息痛的高效液相色譜法測定撲熱息痛的含量含量8024綜合必修王英武楊艷胡良海謝晶周曉雪王靜權(quán)宇彤34月26日星期六830～1130C44545月7日星期三1300～163055月8日星期四1300～16305方法學(xué)驗證方法學(xué)驗證8024綜合必修王英武楊艷胡良海謝晶周曉雪王靜權(quán)宇彤35月10日星期六830～1130C4456綜述論文綜述論文0全體待定C445吉林大學(xué)國家級生物實驗教學(xué)示范中心吉林大學(xué)國家級生物實驗教學(xué)示范中心2014年2月28日

簡介：1生物學(xué)一級生物學(xué)一級學(xué)科（專業(yè)）碩博連續(xù)培養(yǎng)研究生培養(yǎng)方案學(xué)科（專業(yè)）碩博連續(xù)培養(yǎng)研究生培養(yǎng)方案（專業(yè)代碼）一、一、培養(yǎng)目標(biāo)培養(yǎng)目標(biāo)本學(xué)科將為國家培養(yǎng)生物學(xué)科的高級專門人才。本學(xué)科要求所培養(yǎng)的博士生要熱愛祖國，崇尚科學(xué)，誠實守信，團結(jié)協(xié)作；能夠掌握和運用馬列主義唯物主義的辯證法，具有強烈的事業(yè)心、社會責(zé)任感和科學(xué)的獻身精神；具有嚴(yán)謹(jǐn)、謙虛、求實、進取、敬業(yè)的學(xué)風(fēng)和創(chuàng)新性思維等科學(xué)素養(yǎng)。掌握堅實廣博的生物學(xué)基礎(chǔ)知識，熟悉本學(xué)科國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和發(fā)展動態(tài)，系統(tǒng)深入地掌握生物學(xué)科相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域的專門知識及實驗技能；具有獨立從事科研工作的能力；并在科學(xué)或?qū)ｉT技能上獲得創(chuàng)造性的成果。掌握一門外語，具有外語寫作和國際學(xué)術(shù)交流的能力，初步掌握第二外語；具有健康的身體和心理素質(zhì)。二、二級學(xué)科及研究方向二、二級學(xué)科及研究方向1植物學(xué)1）作物分子設(shè)計與種質(zhì)創(chuàng)新主要以小麥，玉米，高粱和大豆為材料，通過分子設(shè)計和基因工程改造，創(chuàng)制高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的作物新品種2）植物發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要以擬南芥和作物為材料，研究植物在生長發(fā)育過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制3）植物激素與環(huán)境適應(yīng)的分子機理以擬南芥和作物為材料，研究植物激素和周圍環(huán)境如逆境，營養(yǎng)缺陷和干旱等信號互作的分子機理2動物學(xué)1）動物遺傳學(xué)主要研究動物染色體結(jié)構(gòu)及其演化；動物功能基因的克??；動物分子系統(tǒng)學(xué)及分子進化等。2）動物生化與分子生物學(xué)主要研究動物蛋白質(zhì)、抗菌肽和酶的純化、性質(zhì)、功能、基因克隆、體內(nèi)表達及調(diào)控和重組表達等。3微生物學(xué)1）微生物生理生化本研究方向從事微生物的生理、代謝及微生物酶的結(jié)構(gòu)與功能等方面的研究，重點研究微生物對纖維素、木素等生物質(zhì)的降解酶及其生物質(zhì)的降解機理。2）資源與環(huán)境微生物學(xué)本研究方向主要開展可再生資源的微生物轉(zhuǎn)化、環(huán)境保護、環(huán)境治理及清潔生產(chǎn)的微生物技術(shù)研究，促進我國的可持續(xù)性發(fā)展。3）微生物遺傳與分子生物學(xué)33）植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)本研究方向主要以擬南芥、玉米、菜豆等為實驗材料，致力于發(fā)掘影響植物生長發(fā)育和參與逆境脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵功能基因，闡明這些功能基因的分子機理，拓展和深化植物激素和逆境脅迫調(diào)控植物生長發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。4）腫廇細(xì)胞生物學(xué)本方向?qū)⒁灾袊烁甙l(fā)腫瘤為研究對象，綜合運用各種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，探究腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機理；腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制；抗腫瘤藥物的作用機理等。5）細(xì)胞分化與轉(zhuǎn)分化本方向主要研究1、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化與凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；2、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化的分子機制；3、腫瘤血管及腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的篩選和其作用機制。6）動物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡TLR在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的分子機理；體內(nèi)和體外BETAARRESTINS介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展中的作用機制；體內(nèi)和體外TLR和BETAARRESTIN之間的相互調(diào)控機理。7生物化學(xué)與分子生物學(xué)1）分子生物學(xué)研究真核生物功能基因表達調(diào)控機理、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因克隆與重組表達、基因工程藥物；研究生物體內(nèi)具有重要作用的酶、蛋白質(zhì)肽、多糖及其它生物大分子的性質(zhì)、純化、結(jié)構(gòu)與功能。2）生物化學(xué)研究多糖、糖的綴合物、復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能，糖的轉(zhuǎn)化與利用等。8海洋生物學(xué)1）海洋微生物學(xué)2）海洋生物資源開發(fā)利用3）海藻與浮游生物學(xué)4）海洋動物學(xué)9生物物理學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能三、學(xué)制與學(xué)習(xí)年限三、學(xué)制與學(xué)習(xí)年限碩博連續(xù)培養(yǎng)研究生學(xué)制5年，學(xué)習(xí)年限一般為57年。四、培養(yǎng)方式四、培養(yǎng)方式1根據(jù)寬口徑、厚基礎(chǔ)的原則，本學(xué)科按生物學(xué)一級學(xué)科招收博士研究生，按二級學(xué)科開設(shè)博士期間專業(yè)基礎(chǔ)課程，由導(dǎo)師或?qū)熃M對學(xué)生進行專業(yè)指導(dǎo)。2本學(xué)科鼓勵研究生的“三種經(jīng)歷”，即海外學(xué)習(xí)經(jīng)歷、第二校園經(jīng)歷和社會實踐經(jīng)歷，在海外

簡介：1細(xì)胞生物學(xué)題庫成卷樣例一細(xì)胞生物學(xué)題庫成卷樣例一B卷院系院系_______________________________專業(yè)專業(yè)_________________________________班級班級_______________________________任課教師任課教師_____________________________姓名姓名_______________________________學(xué)號學(xué)號_________________________________考試說明考試說明1此卷為示例試卷此卷為示例試卷2本試卷包含本試卷包含7個大題，個大題，29個小題。全卷滿分個小題。全卷滿分100分，考試用時分，考試用時120分鐘。分鐘。一、選擇題（從一、選擇題（從4個備選答案中選出個備選答案中選出1項答案，將代碼寫在題后橫線上。本大題共項答案，將代碼寫在題后橫線上。本大題共20分，分，共計共計10小題，每小題小題，每小題20分）分）1構(gòu)成真核細(xì)胞染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是______A單位線B核小體C復(fù)制環(huán)D螺旋管2以下哪種物質(zhì)是細(xì)胞中自由基反應(yīng)的終止劑A維生素CB細(xì)胞色素CC單胺氧化酶D堿性磷酸酶3胞間連絲（PLASMODESMA）存在于______A動物上皮細(xì)胞之間B植物組織細(xì)胞之間C藍藻群體細(xì)胞之間D四聯(lián)球菌各細(xì)胞之間4馬蛔蟲個體發(fā)育到一定階段之后，多數(shù)體細(xì)胞發(fā)生染色體斷裂，致使染色體最終丟失約A10％B25％C50％D85％5檢測標(biāo)本中多糖存在，可用什么反應(yīng)_______A過碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）B米倫反應(yīng)C孚爾根反應(yīng)315光合電子傳遞過程中，電子流是非循環(huán)式還是循環(huán)式，取決于______________把電子交給NADP還是___________________。三、是非題（正確的寫“是”三、是非題（正確的寫“是”，錯誤的寫“否”，錯誤的寫“否”。本大題共。本大題共10分，共計分，共計5小題，每小題小題，每小題20分）分）16無論在原核細(xì)胞還是在真核細(xì)胞中，一般只有在進行多肽合成時，核糖體大、小亞單位才結(jié)合在一起。答（）17實驗細(xì)胞學(xué)的創(chuàng)立與OHERTWIG對海膽和蛔蟲卵發(fā)育過程中核質(zhì)關(guān)系的研究有關(guān)。答（）18構(gòu)成結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的高度重復(fù)DNA，因缺少轉(zhuǎn)錄所必須的啟動子序列，所以不具轉(zhuǎn)錄功能。答（）19發(fā)明利用雜交瘤制做單克隆抗體的是MILESTEIN和。答（）HLEROK20“細(xì)胞來自細(xì)胞”是由FLEMMING首先提出的。答（）四、名詞解釋（本大題共四、名詞解釋（本大題共20分，共計分，共計5小題，每小題小題，每小題40分）分）21鞭毛（FLAGELLUM）22RNA拼接（RNASPLICING）23核移植（NUCLEARTRANSPLANTATION）24核小體（NUCLEOSOME）25古細(xì)菌（原細(xì)菌，ARCHEOBACTERIA）五、問答題（本大題共五、問答題（本大題共10分，共計分，共計1小題。小題。）26（100分）分）試論述核纖層蛋白與其它中間纖維蛋白的關(guān)系。六、填圖繪圖題（本大題共六、填圖繪圖題（本大題共20分，共計分，共計2小題。小題。）27（100分）分）下圖為葉綠體中通過電子傳遞鏈光合磷酸化示意圖，試標(biāo)注數(shù)字所示部分名稱。

簡介：搭建生命搭建生命積木的合成生物學(xué)木的合成生物學(xué)張文韜編譯作品積木搭建生命●合成生物學(xué)能為我們帶來什么隨著科學(xué)家對合成生物學(xué)能為我們帶來什么隨著科學(xué)家對DNADNA“讀寫”能力的進一步提高，生物工程學(xué)創(chuàng)造出“讀寫”能力的進一步提高，生物工程學(xué)創(chuàng)造出了更多的奇跡。了更多的奇跡。如果給人類裝上聲納，我們會像蝙蝠一樣在黑暗中旅行嗎如果人類有從陽光中吸取能量如果給人類裝上聲納，我們會像蝙蝠一樣在黑暗中旅行嗎如果人類有從陽光中吸取能量的基因，我們是否會像植物一樣進行光合作用利用生物學(xué)和工程學(xué)手段，科學(xué)家正在改變著世界的基因，我們是否會像植物一樣進行光合作用利用生物學(xué)和工程學(xué)手段，科學(xué)家正在改變著世界玩過樂高積木嗎將那些色彩豐富、形狀各異的積木按照自己的想象拼在一起就成了一間房子、一只小船或是一座寶塔。在生物學(xué)世界里，科學(xué)家們正試圖將細(xì)胞看成是一套積木，他們在使用基因“積木”和蛋白質(zhì)“積木”創(chuàng)造各種新的細(xì)胞及其新的功能。比如，能夠清理原油泄漏污染的細(xì)菌、能夠防蟲害的水稻、能夠生產(chǎn)新型材料的細(xì)胞，等等。這就是合成生物學(xué)所關(guān)注的如何用新奇有趣的方法對生命重新進行組合。這不僅需要對生物學(xué)有足夠的了解，還需要創(chuàng)造性的工程技術(shù)和計算方法，更需要各學(xué)科的協(xié)作完成?；虿僮骰虿僮髟诤铣缮飳W(xué)出現(xiàn)之前，基因工程在很大程度上只是傳統(tǒng)意義上的遺傳學(xué)。1968年，約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分子生物學(xué)家漢密爾頓史密斯HAMILTONSMITH的一個意外發(fā)現(xiàn)，便奠定了未來數(shù)十年的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。史密斯研究的是流感嗜血桿菌和噬菌體，后者是能感染細(xì)菌的病毒粒子。當(dāng)史密斯用P22噬菌體感染細(xì)菌時，他發(fā)現(xiàn)噬菌體的DNA被降解了。于是，史密斯從中分離出了一種酶，并最終證明這種酶總是切割DNA上某一特定的核苷酸序列，這就是我們今天所說的HINDII酶。HINDII是生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)的第一個限制性內(nèi)切酶，它能識別特定的序列，把DNA切開。菌在黑暗中生長，合成黑色素的基因就被開啟。經(jīng)過特定模式的光照射后，科學(xué)家們就得到了一張由細(xì)菌組成的“照片”。扳鍵開關(guān)及其他早期生物工程電路實例表明，經(jīng)過近三十年的研究，基因操作技術(shù)可以賦予細(xì)胞前所未有的功能。它的意義絕不僅僅是為重組幾個基因創(chuàng)造了條件，即人們可以通過它來重組整個產(chǎn)物合成線路、甚至合成能控制細(xì)胞分裂、生長、復(fù)制和與其他生物相互作用的完整基因組。以藥物合成為例，胰島素等藥物只需在細(xì)菌中插入一個基因就可以大量生產(chǎn)。但是生產(chǎn)其他藥物需要一系列的基因，比如青蒿素它是迄今最有效的抗瘧疾藥物。在此之前，只能從一種叫青蒿的草藥中提取，產(chǎn)量高度依賴于青蒿的數(shù)量。2005年，在加利福尼亞州的勞倫斯伯克利國家實驗室，科學(xué)家們試圖利用酵母這種在實驗室里易于生長的真核單細(xì)胞生物體生產(chǎn)前體青蒿酸。杰伊基斯林JAYKEASLING把一整套在植物中生產(chǎn)青蒿素前體的基因和代謝途徑，連同其他所需基因從不同的生物轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞中生產(chǎn)青蒿酸，可節(jié)約30～60的成本。目前這個過程處在研究的末段，藥物預(yù)計于2012年面世。盡管合成生物學(xué)仍處在起步階段，如何向前推進就如同組裝一臺機器，不僅要有創(chuàng)造性的工程技術(shù)和計算方法，更需要各個學(xué)科的協(xié)同合作閱讀、復(fù)制、合成閱讀、復(fù)制、合成基因遺傳密碼就像是一門語言，要學(xué)會使用它，你必須首先學(xué)習(xí)如何閱讀并理解它。在考古學(xué)家發(fā)現(xiàn)古代瑪雅象形文字的意義之前，它是一個未解密的代碼，沒有人能用瑪雅文書寫。遺傳密碼也是如此，我們的DNA曾經(jīng)也是未解密的代碼。不過，一個世紀(jì)以來，科學(xué)家們已經(jīng)逐漸學(xué)會如何讀懂每一個細(xì)胞的遺傳密碼。他們已弄清，哪些基因決定細(xì)胞和生物體的哪些特點，改變基因又會如何相應(yīng)地改變這些特點。目前，研究人員正努力利用遺傳語言中的四個字母A，G，T，C也就是核苷酸來書寫DNA，構(gòu)建新基因或基因的組合。上述合成生物學(xué)的例子是建立在理解基因密碼的基礎(chǔ)上，也就是說，知道序列與功能之間的聯(lián)系。此外，我們還須盡可能多地生產(chǎn)所需基因拷貝數(shù)。1985年，化學(xué)家卡里穆利斯KARYMULLIS開發(fā)出一種能快速復(fù)制基因的方法被稱為聚合酶鏈反應(yīng)PCR。PCR是在試管中反復(fù)進行的一種DNA復(fù)制反應(yīng)，用加熱變性、冷卻退火、保溫延伸等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，每一次循環(huán)，反應(yīng)體系中的DNA分子增加約一倍，可使DNA無限擴增。這項技術(shù)已經(jīng)有25年的歷史，但科學(xué)家們?nèi)栽诓粩鄬ふ腋玫姆椒焖俸铣蒁NA序列。2009年，哈佛大學(xué)的喬治丘奇GEGECHURCH公布了基于PCR等多項技術(shù)的新型技術(shù)，研究人員可以合成出數(shù)百萬條基于同一DNA鏈、卻又相互之間存在微小差別的DNA鏈從中找出有特殊功能的基因。丘奇用這種方法找到了一種大腸桿菌，能生產(chǎn)高于正常水平的蕃茄紅素。番茄紅素是在番茄中發(fā)現(xiàn)的一種鮮紅色化合物，有著預(yù)防某些癌癥的作用。丘奇的研究表明，研究人員可以針對任何所需的細(xì)胞特性進行篩查，不僅僅是番茄紅素，還能從隨機制造的細(xì)菌中篩選出具有產(chǎn)生生物燃料或消化溢油等能力的細(xì)菌。2010年，生物學(xué)家克雷格文特爾CRAIGVENTER、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)者史密斯等人合成了一條含有100萬對堿基的DNA，并將其轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中他們把一個細(xì)菌的全基因組用計算機編寫成數(shù)字文件，然后將文件信息翻譯成許多DNA片段。最后，把那些DNA片段連接在一起合成為細(xì)菌的基因組，并經(jīng)過

簡介：平菇P0902菌株的生物學(xué)特性摘要對平菇P0902菌株的生物學(xué)特性試驗，試驗的結(jié)果表明，菌絲生長最適溫度（試管斜面種）26℃，最適PH值55～65，培養(yǎng)料（棉籽皮）最適含水量為59～65；且抗雜性強，子實體商品性較好，產(chǎn)量高。關(guān)鍵詞平菇P0902菌株；生物學(xué)特性；產(chǎn)量中圖分類號S6461文獻標(biāo)識碼A文章編號16740432（2013）04010122009年9月2日，筆者在延安市寶塔區(qū)萬花鄉(xiāng)原農(nóng)機站院內(nèi)一株枯死的楊樹樹莖基部，采集到一株野生平菇菌株，經(jīng)組織分離馴化培養(yǎng)后，定名為“P0902”。筆者對該菌株進行了生物學(xué)特性的試驗，先將試驗報告如下。1材料與方法11供試菌株平菇P0902。CK12106；CK2山西89；CK32002；CK4650。CK菌株均引自延安市寶塔區(qū)何莊坪鎮(zhèn)菇農(nóng)。12供試培養(yǎng)基母種培養(yǎng)基棉籽殼200G、葡萄糖20G、蛋白胨6GKH2PO33G、MGSO415G、瓊脂20G、H2O1000ML。原種培養(yǎng)基（料）棉籽殼92、玉米面5、磷肥1～2、熟石灰P0902的產(chǎn)量。2結(jié)果與分析21菌絲生長最適溫度試驗結(jié)果從表1數(shù)據(jù)可以得出，P0902菌絲（母種）生長最適溫度為26℃。22菌絲生長適宜酸堿度實驗結(jié)果從表2數(shù)據(jù)得出，P0902菌絲生長最適PH值為55～65。23菌絲抗雜試驗結(jié)果從表3可以看出，P0902菌株抗雜能力較強，可以進行生料栽培。24原種培養(yǎng)料含水量試驗從表4數(shù)據(jù)可以得出，P0902菌株原種培養(yǎng)料的最適含水量為59～65。25生物學(xué)效率試驗P0902菌株子實體由5～12片菇片組成，覆瓦狀排列。頭潮菇直徑7～12CM，厚度（孢子散發(fā)前）為2～3CM。常溫下，菇蓋幼時黑色，成熟時黑灰色，菌褶白色。頭潮菇單叢10～18KG。菇柄粗、短，軟柄。從本試驗得出，P0902菌株子實體商品性較好，韌性適中，產(chǎn)量與本地主栽品種不相上下。3實驗小結(jié)（1）平菇P0902菌株母種菌絲生長最適溫度為26℃，而二、三級種及出菇菌袋因料溫高，環(huán)境溫度應(yīng)控制在26℃以下。（2）平菇P0902菌株菌絲生長最適PH值55～65?？闺s能力較強，可進行生料栽培。

簡介：人教版八年級生物學(xué)下冊人的性別遺傳教學(xué)設(shè)計格桑錯那縣中學(xué)③答較小的那條Y染色體?。╔染色體大，Y染色體?。＂艽鹁雍吐鸭?xì)胞中都只能含有一條性染色體。精子含有X染色體或Y染色體的。卵細(xì)胞只含有X染色體。（三）突破難點（10分鐘）1、出示（、出示（PPTPPT）精子與卵細(xì)胞隨機結(jié)合）精子與卵細(xì)胞隨機結(jié)合2、遺傳圖解以性染色體為例男性精子X或Y；女性卵細(xì)胞X。精子和卵細(xì)胞結(jié)合成XY（男性），結(jié)合成XX（女性）。3、課內(nèi)拓展資料我國歷次全國人口普查統(tǒng)計結(jié)果時間人數(shù)（億）男女比例1953年58210661001964年69510551001982年100810631001990年11310661002000年126610671002010年13701052100調(diào)查范圍越大越接近11（四）課堂小節(jié)（4分鐘）1、小結(jié)性提問（學(xué)生思考并回答）“這節(jié)課你學(xué)到了什么然后再加以補充。2、小結(jié)內(nèi)容如下人男性體細(xì)胞為22對XY類男女染色體的差別女性體細(xì)胞為22對XX的Y染色體在形態(tài)比X染色體短一些性別精子有兩種２２條＋X遺生男生女機會均等２２條＋Y

簡介：微生物學(xué)課程教學(xué)模式改革探討微生物學(xué)課程教學(xué)模式改革探討【摘要】課程教學(xué)模式改革是提高高校教育質(zhì)量的重要措施，環(huán)境學(xué)科中微生物學(xué)課程內(nèi)容繁雜瑣碎，涉及面廣，學(xué)生在學(xué)習(xí)中感性認(rèn)知較差，且學(xué)習(xí)興趣低，導(dǎo)致學(xué)習(xí)效果差。針對課程教學(xué)中存在的一些問題，論文從教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法等環(huán)節(jié)提出一些措施與建議，以使其更符合本科專業(yè)學(xué)生的需求。下載【ABSTRACT】THEREFMOFTEACHINGMODEISANIMPTANTMEASURETOIMPROVETHEQUALITYOFHIGHEREDUCATION，THECURRICULUMOF“MICROBIOLOGY“INENVIRONMENTALSCIENCEISCOMPLICATEDTRIVIAL，COVERINGAWIDERANGE，INTHISCOURSE，THEPERCEPTUALCOGNITIVETHELEARNINGINTERESTFSTUDENTSISLOW，THENLEADINGTOAPOLEARNINGEFFING，THISPAPERPUTSFWARDSOMEMEASURESSUGGESTIONSFROMTEACHINGCONTENTSTEACHINGMETHODS，MAKINGITMESUITABLEFUNDERGRADUATESTUDE關(guān)鍵詞】微生物學(xué)；環(huán)境學(xué)科；教學(xué)改革【KEYWDS】MICROBIOLOGY；ENVIRONMENTALSCIENCE；TEACHINGREFM【中圖分類號】G6424【文獻標(biāo)志碼】A【文章編號】16731069（2017）070077021引言微生物學(xué)是浙江省紹興文理學(xué)院環(huán)境科學(xué)專業(yè)的基礎(chǔ)理論課程，總學(xué)時為40課時，面向大二學(xué)生開設(shè)的課程。微生物學(xué)是環(huán)境科學(xué)專業(yè)必修的一門專業(yè)平臺課。該課程主要介紹微生物的形態(tài)特征、生理功能、微生物與環(huán)境的關(guān)系。具體內(nèi)容包括微生物的生態(tài)；環(huán)境中主要微生物的類群；微生物的生長代謝與遺傳變異及生長繁殖等；水環(huán)境污染控制與治理的工程應(yīng)用及微生物學(xué)原理；微污染源水預(yù)處理中的微生物學(xué)原理及污、廢水深度處理；微生物學(xué)新技術(shù)的應(yīng)用；有機固體廢棄物和廢氣的微生物處理及其微生物群落。它是一門將理論知識與實踐內(nèi)容密切結(jié)合的課程。因此，在教學(xué)過程中，應(yīng)注重培養(yǎng)學(xué)生的實踐能力，培養(yǎng)和打造應(yīng)用型復(fù)合人才。然而微生物學(xué)目前教學(xué)模式比較單一，教學(xué)方式主要為教師單向講授，學(xué)生被動接受的形式。因此需要對其進行教學(xué)模式改革，以適應(yīng)新時期的要求。2微生物學(xué)教學(xué)模式存在的主要問題21內(nèi)容多、課時少微生物學(xué)由兩大部分組成，第一部分是微生物學(xué)基礎(chǔ)，第二部分是微生物生態(tài)與環(huán)境生態(tài)工程中的微生物作用。微生物學(xué)基礎(chǔ)部分包括①病毒②原核微生物③微生物的生理④真核微生物⑤微生物的生長繁殖與生存因子⑥微生物的遺傳和變異六大部分；微生物生態(tài)與環(huán)境生態(tài)工程中的微生物作用包括①微生物的生態(tài)②水環(huán)境污染控制與治理的生態(tài)工程及微生物學(xué)原理③微生物在環(huán)境物質(zhì)循環(huán)中的作用④污水深度處理和微污染水預(yù)處理中的微生物學(xué)原理⑤有機固體廢物與廢氣的微生物處理及其微生物群落⑥微生物學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用等六大部分，內(nèi)容多且雜。教學(xué)容量?，F(xiàn)代教學(xué)手段也有利于學(xué)生對教學(xué)內(nèi)容的理解，將微觀的肉眼不可見的微小生物，直觀呈現(xiàn)在學(xué)生眼前，從而更好地理解課本內(nèi)容，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。42積極組織認(rèn)識實習(xí)，注重理論聯(lián)系實際可安排一定的課時帶領(lǐng)學(xué)生到污水處理廠和固體廢物生物填埋場等場地進行參觀實習(xí)，加深學(xué)生對專業(yè)基礎(chǔ)課的理解，找到理論與實踐的結(jié)合點。43結(jié)合專業(yè)及生活實例進行講授，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣學(xué)生在學(xué)習(xí)本課程前，主要學(xué)習(xí)了數(shù)學(xué)、物理和基礎(chǔ)化學(xué)等課程，相關(guān)專業(yè)課程尚未展開學(xué)習(xí)，所以學(xué)生對環(huán)境工程專業(yè)為什么學(xué)習(xí)微生物知識缺乏認(rèn)識，環(huán)境中存在的微生物由于其個體微小，用肉眼觀測不到，離日常生活較遠(yuǎn)，需要運用抽象思維去理解，學(xué)生容易感覺枯燥。針對這一情況，可在相關(guān)章節(jié)引入微生物在日常生活中的案例，將原理和現(xiàn)象相結(jié)合，使學(xué)生有更為形象的認(rèn)識，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。44優(yōu)化實驗教學(xué)內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力微生物學(xué)是一門實踐性和應(yīng)用性都很強的學(xué)科，通過微生物實驗的開展，可以使學(xué)生更好地理解理論知識，帶給學(xué)生更加直觀的感受。45注重學(xué)科前沿，開拓教學(xué)新領(lǐng)域環(huán)境微生物學(xué)是一門新興的邊緣學(xué)科，隨著微生物學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)的不斷發(fā)展而呈現(xiàn)出更多新的內(nèi)容。教師的知識結(jié)構(gòu)需及時更新，及時跟蹤學(xué)科前沿動態(tài)，把微生物學(xué)的最新研究成果穿插在教學(xué)中，把科學(xué)前沿的最新動態(tài)體現(xiàn)在教學(xué)中。46完善考核評價體系在課程考核中采用綜合考評的方式，把學(xué)生成績進行分類評定即由平時成績（20）和期末考試（80）兩個部分組成，平時成績由四部分組成課堂表現(xiàn)、考勤、小組討論、課后作業(yè)。期末考試的試題增加綜合題的比例，將工程案例與知識點相結(jié)合出題，讓學(xué)生養(yǎng)成勤于思考、善于總結(jié)的學(xué)習(xí)習(xí)慣。5結(jié)語微生物學(xué)是一門理論與實踐并重的學(xué)科，它在環(huán)境工程領(lǐng)域中扮演著越來越重要的角色，課程教學(xué)改革是一個長期而艱巨的任鍘＝萄內(nèi)容要適應(yīng)環(huán)境工程學(xué)科的發(fā)展；教學(xué)方法要更多地運用現(xiàn)代化教學(xué)手段來輔助；要培養(yǎng)學(xué)生把理論知識應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)實踐環(huán)節(jié)，以期實現(xiàn)環(huán)境工程微生物教學(xué)改革的目標(biāo)，培養(yǎng)具有獨立工作能力、綜合能力及創(chuàng)新能力的高素質(zhì)人才?！緟⒖嘉墨I】【1】周群英，王士芬環(huán)境工程微生物學(xué)（第3版）M北京高等教育出版社，2008【2】黃瑤，黃翠姬，伍時華，等改革微生物學(xué)實驗教學(xué)方法，提高學(xué)生綜合能力J微生物學(xué)通報，2009，36（6）914917【3】李正鵬，吳萍，祝嫦巍，等微生物工程課程教學(xué)改革的探索與實踐J廣東化工，2013，40（1）149

簡介：02017年普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)2016年7月20日版（修訂稿）普通高中生物學(xué)課標(biāo)研制組目錄一、課程性質(zhì)與基本理念1（一）課程性質(zhì)1（二）基本理念1二、學(xué)科核心素養(yǎng)與課程目標(biāo)2（一）學(xué)科核心素養(yǎng)2（二）課程目標(biāo)3三、課程結(jié)構(gòu)3（一）設(shè)計依據(jù)3（二）結(jié)構(gòu)4（三）學(xué)分與選課4四、課程內(nèi)容4（一）必修課程4模塊1分子與細(xì)胞4模塊2遺傳與進化6（二）選修Ⅰ課程8模塊1穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)8模塊2生物與環(huán)境10模塊3生物技術(shù)與工程12（三）選修Ⅱ課程14現(xiàn)實生活應(yīng)用14職業(yè)規(guī)劃前瞻16學(xué)業(yè)發(fā)展基礎(chǔ)19五、學(xué)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)22（一）學(xué)業(yè)質(zhì)量水平22（二）說明25六、實施建議25（一）教學(xué)與評價建議25Ⅰ教學(xué)建議Ⅱ評價建議27（二）學(xué)業(yè)水平測試與高考命題建議Ⅰ學(xué)業(yè)水平測試Ⅱ高考命題建議（三）教材編寫建議1教科書編寫的基本原則2教科書內(nèi)容的選擇3教科書內(nèi)容的組織和呈現(xiàn)方式（四）地方和學(xué)校實施本課程的建議1精心規(guī)劃并全面落實高中生物學(xué)課程2生的主動學(xué)習(xí)，對教師的課堂教學(xué)提出了更高的要求。最后，“精”是對學(xué)生學(xué)習(xí)結(jié)果的定位，學(xué)生在本課程結(jié)束后，應(yīng)該能夠?qū)χ匾纳飳W(xué)概念有較好的理解和應(yīng)用，進而形成生物學(xué)核心素養(yǎng)，而不是僅僅對知識的記憶和背誦。3教學(xué)過程重實踐教學(xué)過程重實踐本課程的價值是要讓學(xué)生在形成生物學(xué)核心素養(yǎng)的同時，能用科學(xué)的觀點、知識、思路和方法，面對或解決現(xiàn)實生活中的某些問題。要達成這樣的課程目標(biāo)，就要高度關(guān)注教學(xué)過程中的實踐經(jīng)歷?！爸貙嵺`”強調(diào)學(xué)生學(xué)習(xí)的過程是主動參與的過程，教師既要讓學(xué)生參與動手活動，又要讓學(xué)生積極地融入涉及動腦的環(huán)節(jié)；通過探究類學(xué)習(xí)活動或完成工程學(xué)任務(wù)，加深學(xué)生對生物學(xué)概念的理解，提升應(yīng)用知識的能力；要適當(dāng)?shù)貙⒖鐚W(xué)科知識和技能融入實踐活動，特別是將“科學(xué)、技術(shù)、工程學(xué)和數(shù)學(xué)”（STEM）整合到實踐活動中，以適應(yīng)在教學(xué)中對超越學(xué)科本身知識和能力的要求；要在教學(xué)中將生物學(xué)與學(xué)生的日常生活、醫(yī)療保健、環(huán)境保護和經(jīng)濟活動等內(nèi)容適度結(jié)合，指導(dǎo)學(xué)生在現(xiàn)實生活背景中學(xué)習(xí)生物學(xué)，進而能運用生物學(xué)原理和方法參與公眾事務(wù)的討論或作出相關(guān)的個人決策。4學(xué)業(yè)評價促發(fā)展學(xué)業(yè)評價促發(fā)展本課程的設(shè)計和實踐者要以生物學(xué)核心素養(yǎng)為目標(biāo)，通過研讀學(xué)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，把握本課程的宏觀教育目標(biāo)，明確評價的教學(xué)和育人價值，實現(xiàn)從內(nèi)容本位、學(xué)科本位向素養(yǎng)本位、學(xué)生發(fā)展本位為目標(biāo)的評價理念的根本性轉(zhuǎn)變。要處理好評價與學(xué)生發(fā)展的關(guān)系。評價不僅要關(guān)注學(xué)生的學(xué)業(yè)成績，更應(yīng)關(guān)注個體的進步和多方面的發(fā)展?jié)撃堋Ｒ私鈱W(xué)生發(fā)展中的需求，幫助學(xué)生認(rèn)識自我，建立自信，發(fā)揮好評價的診斷作用、激勵作用和促進作用。通過評價使每一個學(xué)生都能夠體驗到在原有水平上的發(fā)展，并從中得到啟示，使評價能更好地服務(wù)于教育教學(xué)實踐。二、二、學(xué)科核心素養(yǎng)與課程目標(biāo)學(xué)科核心素養(yǎng)與課程目標(biāo)（一）學(xué)科核心素養(yǎng)（一）學(xué)科核心素養(yǎng)生物學(xué)核心素養(yǎng)是學(xué)生后天習(xí)得的終身受益成果，是公民基本素養(yǎng)的重要組成之一，是學(xué)生在解決真實情境中的生物學(xué)問題時所表現(xiàn)出來的必備品格和關(guān)鍵能力。生物學(xué)核心素養(yǎng)主要包括生命觀念、理性思維、科學(xué)探究和社會責(zé)任等，其內(nèi)涵和表現(xiàn)如下。1生命觀念生命觀念“生命觀念”是指對觀察到的生命現(xiàn)象及相互關(guān)系或特性進行解釋后的抽象，是經(jīng)過實證后的想法或觀點，是能夠理解或解釋相關(guān)事件和現(xiàn)象的品格和能力。學(xué)生應(yīng)該在較好地理解生物學(xué)概念的基礎(chǔ)上形成生命觀念，如結(jié)構(gòu)與功能觀、進化與適應(yīng)觀、穩(wěn)態(tài)與平衡觀、物質(zhì)與能量觀等。能夠用生命觀念認(rèn)識生物的多樣性和統(tǒng)一性，形成科學(xué)的自然觀和世界觀，指導(dǎo)探究生命活動規(guī)律，解決實際問題。2理性思維理性思維“理性思維”是指尊重事實和證據(jù)，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)和務(wù)實的求知態(tài)度，運用科學(xué)的思維方法認(rèn)識事物、解決實際問題的思維習(xí)慣和能力。學(xué)生應(yīng)該在學(xué)習(xí)過程中逐步發(fā)展理性思維，如能夠基于生物學(xué)事實和證據(jù)運用歸納與概括、演繹與推理、模型與建模、批判性思維等方法，探討、闡釋生命現(xiàn)象及規(guī)律，審視或論證生物學(xué)社會議題。3科學(xué)探究科學(xué)探究“科學(xué)探究”是指能夠發(fā)現(xiàn)現(xiàn)實世界中的生物學(xué)問題，針對特定的生物學(xué)現(xiàn)象，進行觀察、提問、實驗設(shè)計、方案實施以及結(jié)果的交流與討論的能力。在探究中，樂于并善于團隊合作，勇于創(chuàng)新。4社會責(zé)任社會責(zé)任

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簡介：2024/3/26,1,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗技術(shù),2024/3/26,2,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,一、蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)及其依據(jù),2024/3/26,3,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,二、蛋白質(zhì)純化的一般設(shè)計原則,1、目的蛋白的分離和純化應(yīng)該盡可能選擇來源方便、成本低、易操作的組織或細(xì)胞作為原料；,2、要建立一個特異、快速、可重復(fù)、經(jīng)濟的目的蛋白活性檢測方法；,3、蛋白質(zhì)分離純化工藝的設(shè)計應(yīng)該分級分離、先粗后細(xì)的原則；,4、純化條件要盡可能溫和。,2024/3/26,4,第一章蛋白質(zhì)的分離與純化,第二節(jié)蛋白質(zhì)的層析CHROMATOGRAPHY分離,一、層析技術(shù)的發(fā)展簡史及科學(xué)意義,二、層析技術(shù)的基本原理,固定相在層析系統(tǒng)分離過程中靜止不動的相。,流動相在層析系統(tǒng)分離過程中在載體上延一定方向移動的相。,2024/3/26,5,2024/3/26,6,2024/3/26,7,塔板理論,把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。,2024/3/26,8,塔板理論假設(shè)1在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVM）。3所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。,2024/3/26,9,簡單地認(rèn)為在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為NL/HN稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)N的增加而增加，隨板高H的增大而減小。,2024/3/26,10,2024/3/26,11,2024/3/26,12,2024/3/26,13,洗脫法也稱沖洗法。工作時，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。流出曲線下圖。,層析的展開方式,2024/3/26,14,頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強的最后流出。頂替法的流出曲線如下圖。,2024/3/26,15,2024/3/26,16,迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱，吸附或溶解能力最弱的組分首先一純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如下圖。,AB,A,,2024/3/26,17,層析流出曲線及相關(guān)術(shù)語,色譜流出曲線和色譜峰由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。,2024/3/26,18,基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。,峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（H）表示。,2024/3/26,19,色譜流出曲線色譜流出曲線和色譜峰基線（A）峰高（H）,2024/3/26,20,保留值死時間T0不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。,因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與T0的比值計算，即ūL/T0,2024/3/26,21,,2保留時間TR試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間，如下圖。,2024/3/26,22,3調(diào)整保留時間TR′某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即TR′TR?T0由于組分在色譜柱中的保留時間TR包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以TR實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。,2024/3/26,23,4死體積V0指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速FCO（CM3MIN1）計算。V0T0FCO式中FCO為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。,2024/3/26,24,5保留體積VR指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關(guān)系VRTRFCO6調(diào)整保留體積VR?某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。VR?VR?V0TR?FCO,2024/3/26,25,7相對保留值R2,1某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。R2,1TR2?/TR1′VR2?/VR1?由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。,2024/3/26,26,在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（S），然后再求其它峰（I）對這個峰的相對保留值，此時可用符號?表示，即?TR?I/TR?S式中TR?I為后出峰的調(diào)整保留時間，所以?總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。,2024/3/26,27,1標(biāo)準(zhǔn)偏差?即0607倍峰高處色譜峰寬的一半。2半峰寬W1/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為W1/22354?3峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差?的關(guān)系是W4?,2024/3/26,28,2024/3/26,29,從色譜流出曲線中，可得許多重要信息I根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；II根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；III根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；IV色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)；V色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。,2024/3/26,30,三、離子交換層析,離子交換層析IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY利用物質(zhì)的電荷與層析載體離子交換劑電荷之間的相互作用達到分離純化的目的的層析方法稱離子交換層析。,離子交換劑離子交換層析所用的固相基質(zhì)，由不溶于水的、具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物組成。,2024/3/26,31,2024/3/26,32,離子交換層析的操作,1、樣品的準(zhǔn)備固體樣品必須溶于適當(dāng)離子強度和PH的緩沖液中。組織液或細(xì)胞裂解液用緩沖液稀釋后可直接上柱。鹽析樣品必須除鹽后才能進行分離。,2、離子交換劑的處理根據(jù)被分離樣品的性質(zhì)選擇合適的離子交換劑，離子交換劑在使用前須先進行處理。,2024/3/26,33,3、層析柱的準(zhǔn)備離子交換層析柱一般選擇粗短柱為宜，使得樣品在分離的同時進行濃縮。離子交換劑的用量根據(jù)樣品量和交換劑的交換容量確定。,4、樣品分離上樣量的多少與目的蛋白的性質(zhì)、濃度及交換劑的親和力有關(guān)。在分離過程中，應(yīng)注意,2024/3/26,34,1）樣品的濃度不宜過大2）溶解蛋白質(zhì)樣品的緩沖液的離子強度要低于起始緩沖液3）上樣速度不要過快4）上樣緩沖液的PH應(yīng)合適,5、洗脫,2024/3/26,35,6、洗脫液的鑒定和回收,7、離子交換劑的再生與儲存,2024/3/26,36,2024/3/26,37,兔Γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分離,2024/3/26,38,天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離,2024/3/26,39,2024/3/26,40,2024/3/26,41,二、分子篩原理,2024/3/26,42,2024/3/26,43,2024/3/26,44,凝膠過濾的分配系數(shù),2024/3/26,45,主要凝膠過濾介質(zhì)的牌號及骨架結(jié)構(gòu),2024/3/26,46,,葡聚糖凝膠G,2024/3/26,47,親和層析利用生物分子間特殊的親和關(guān)系進行的分離方法。是蛋白質(zhì)分離純化的最有效的方法之一，有時甚至可以僅用一步純化即可達到純化目的。只要被分離蛋白、配基和載體之間能形成以下的關(guān)系，即可進行親和層析,2024/3/26,48,2024/3/26,49,基本原理親和層析法利用了生命現(xiàn)象中生物分子之間非常特異的相互作用而進行分離純化的方法。生物體內(nèi)能發(fā)生特異的相互作用的成分有,,酶與酶的底物,酶與酶的抑制劑,酶與酶的變構(gòu)效應(yīng)劑,酶與酶的輔酶,激素與細(xì)胞膜上的受體,維生素與結(jié)合蛋白,核酸,抗原與抗體,外源凝集素與紅細(xì)胞表面的抗原,2024/3/26,50,2024/3/26,51,電泳是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象,蛋白質(zhì)的電泳分離,2024/3/26,52,,,,,,,蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀,帶正電荷的蛋白質(zhì),帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),在等電點的蛋白質(zhì),酸,酸,堿,堿,脫水,脫水,脫水,不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）,帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）,堿,酸,（親水膠體）,（親水膠體）,（親水膠體）,2024/3/26,53,帶電顆粒在電場中所受到的電場力,FEQ,根據(jù)STOKE定律，球形分子在液體中泳動所受到的阻力,F’6ΠRΗV,電泳原理,2024/3/26,54,FF’,即EQ6ΠRΗV時，,當(dāng)物質(zhì)在電場中移動時，受到電場力和液體阻力兩方面的力的影響，當(dāng)電場力和阻力平衡時，帶電顆粒作勻速運動，,2024/3/26,55,兩個帶電顆粒能否分開，由兩個顆粒在電泳過程中的遷移率所決定，即,或,2024/3/26,56,遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度，可用下列公式計算ＵΥ/ED/T/V/LDL/VTＵ為遷移率（CM2V1MIN1）；Υ為顆粒泳動速度（CMS1）；E為電場強度（VCM1）；D為顆粒泳動的距離（CM）；L為濾紙有效長度（CM）；V為實際電壓（V）；T為通電時間（S或MIN）。通過測量D,L,V,T,即可計算出被分離物質(zhì)的遷移率。,2024/3/26,57,影響電泳的因素,1、帶電粒子的性質(zhì)與電泳行為,2、電場強度對帶電粒子遷移的影響電場強度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。,2024/3/26,58,3、溶液的PH對帶電粒子遷移的影響溶液的PH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。,4、電滲對電泳的影響電滲是在電場中液體對固體的相對移動。,2024/3/26,59,電滲作用,2024/3/26,60,5、離子強度對電泳的影響電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運動粒子符號相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。,2024/3/26,61,6、溫度對的電泳的影響電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加24。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。,2024/3/26,62,電泳的分類和特點,電泳的分類,,自由移動界面電泳,區(qū)帶電泳,穩(wěn)態(tài)電泳,2024/3/26,63,自由移動界面電泳（MOVINGBOUNDARYELECTROPHORESIS），沒有支持物，在一個U形管中進行電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。,區(qū)帶電泳（ZONEELECTROPHORESIS）在一定的支持物上進行的電泳，電泳結(jié)果形成一條條的區(qū)帶而得名。,穩(wěn)態(tài)電泳（STEADYSTATEELECTROPHORESIS）帶電顆粒電泳一定時間后達到穩(wěn)態(tài)而停止移動。,2024/3/26,64,2024/3/26,65,聚丙烯酰胺凝膠電泳（POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS,PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺ACR和交聯(lián)劑N,N’甲叉雙丙烯酰胺BIS聚合而成,2024/3/26,66,,,2024/3/26,67,聚合過程需要有催化劑參加，有兩種聚合方式，化學(xué)聚合和光聚合。催化劑包括引發(fā)劑和加速劑兩部分組成。化學(xué)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑常為過硫酸銨，過硫酸銨首先形成自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)。加速劑四甲基乙二胺（TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE，TEMED）可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度；光學(xué)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑為核黃素。,2024/3/26,68,聚丙烯凝膠的特點,①在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；,②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；,③對PH和溫度變化較穩(wěn)定；,④幾乎無電滲作用，只要ACR純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性極好。,⑤樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達106G。,⑥凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。,⑦分辯率高，尤其在不邊疆凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。,2024/3/26,69,凝膠孔徑及其有關(guān)性質(zhì),①凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系凝膠的孔徑、機械性能、彈性、透明度、黏度和聚合程度取決于凝膠總濃度和ACR與BIS之比。,2024/3/26,70,A/B與凝膠的機械性能密切相關(guān)。當(dāng)（A/B）100時，即使5的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制（A/B）30左右。T一般為510。,②凝膠濃度與孔徑的關(guān)系T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān)系極為密切。一般講，T越大，孔徑越小。此外，孔徑還同BIS與ACR的比例有關(guān)，BIS占ACR總濃度5時，孔徑最小。,③凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量有關(guān)。,2024/3/26,71,2024/3/26,72,聚丙烯酰胺凝膠電泳,,垂直平板電泳,水平板電泳,圓盤電泳,,連續(xù)電泳,不連續(xù)電泳,DISC電泳,2024/3/26,73,丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用,聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，PH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、PH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。,2024/3/26,74,,在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng),，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。１、電荷效應(yīng)各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。２、分子篩效應(yīng)區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。,2024/3/26,75,濃縮效應(yīng),,2024/3/26,76,2024/3/26,77,2024/3/26,78,2024/3/26,79,§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法,SDS－PAGE電泳是應(yīng)用聚丙烯凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的一種有效的方法。SDS是陰離子變性劑，使蛋白質(zhì)分子變性為直鏈狀，且其所帶陰離子將蛋白質(zhì)分子所帶電荷完全履蓋，具有相似的荷質(zhì)比，電泳過程完全與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)。電泳結(jié)束后的凝膠用考馬斯亮蘭或銀染后與已知分子量的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較得出。,2024/3/26,80,2024/3/26,81,§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法,二維電泳是等電聚焦電泳與SDS－PAGE電泳結(jié)合的雙向電泳。電泳過程用柱狀等電聚焦電泳后再行SDS－PAGE電泳，等電聚焦電泳利用蛋白質(zhì)等電點進行分離，SDS－PAGE根據(jù)蛋白質(zhì)分子量實現(xiàn)分離。因為等電點相同而分子量也相同的蛋白質(zhì)幾乎是不存在的，所以二維電泳可將所有蛋白質(zhì)分子分開。,2024/3/26,82,2024/3/26,83,2024/3/26,84,2024/3/26,85,等電點聚焦（ISOELECTRICFOCUSING）,原理在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體AMPHOLYTE,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其PK和PI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極PH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的PH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量,2024/3/26,86,2024/3/26,87,兩性電解質(zhì)1AMPHOLINE瑞典LKB它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,PH范圍2545，465，58，3595,2024/3/26,88,SERVALYTE德國SERVA公司它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團或磷酸基團合成的PH范圍24,35、46、57、68、79、911、211、310,2024/3/26,89,毛細(xì)管電泳,毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（?275ΜM）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。,毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。,2024/3/26,90,2024/3/26,91,

簡介：第三節(jié)分子生物學(xué)診斷技術(shù),一、DNA探針DNAPROBE技術(shù),1基本原理,DNA探針是帶有標(biāo)記物的已知序列的DNA片段。DNA探針技術(shù)的基本原理是堿基配對。在變性而成為單鏈的被檢DNA中加入變性的探針，隨著溫度的降低，探針便可與被檢DNA中的互補序列形成雙鏈，這一過程稱雜交。,2DNA探針的種類,按DNA探針的來源可分為CDNA探針和基因組DNA探針和動基體DNAKDNA三大類,CDNA探針是將病原的MRNA反轉(zhuǎn)錄為DNA后獲得的。其檢測的對象往往是在生命活動中可以被激活并進行表達的基因DNA,基因組DNA探針來源于基因組。在寄生蟲上常用基因組重復(fù)序列作為探針。這些重組序列在基因中高度重復(fù)，拷貝數(shù)很多，便于檢出。但這些重復(fù)序列并不一定表達,KDNA探針是較特殊的一類。在動基體目原生動物中存在動基體，內(nèi)含大量環(huán)狀DNA，分大環(huán)和小環(huán)兩種。其中小環(huán)拷貝數(shù)占絕對多數(shù)。故往往以克隆的小環(huán)或小環(huán)片段做為探針,近年來，人們往往根據(jù)已知的序列，人工合成寡聚DNA片段做為DNA探針,3DNA探針的標(biāo)記物及標(biāo)記,用于DNA探針標(biāo)記的有效射性同位素和非放射性標(biāo)記物常用的放射性同位素有32P、35S、14C、125I等,非放射性標(biāo)記法可將生物素、地高辛連接在DNTP上，然后象放射性標(biāo)記一樣摻入到核酸鏈中制備標(biāo)記探針,4DNA雜交,雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜NITROCELLULOSEFILTERMEMBRANE，簡稱NC膜或尼龍膜NYLONMEMBRANE,固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測,用探針對細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。,其特點是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)，以確定有無該病原體的感染。,原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨特的意義,雜交的第一步是將DNA或RNA轉(zhuǎn)移到膜上,斑點印跡DOTBLOT將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點樣后的膜進行80℃真空烘烤2H,應(yīng)用斑點印跡技術(shù)，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應(yīng)用較廣，適合進行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測基因的分子量,SOUTHERN印跡SOUTHERNBLOT是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程,常規(guī)處理如下，先用限制性內(nèi)切酶對DNA樣品進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對位置保持不變。,SOUTHERN印跡的方法有3種，分別為毛細(xì)管轉(zhuǎn)移或虹吸印跡，電轉(zhuǎn)移和真空印跡，詳細(xì)操作可參閱有關(guān)書籍,SOUTHERN印跡后的濾膜仍需進行固定處理，對NC膜可用80℃真空烘烤2H，對尼龍膜還可用短波紫外線波長254NM照射幾分鐘,NORTHERN印跡NORTHERNBLOT是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。RNA的變性方法與DNA不同，RNA不能用堿變性，因為堿會導(dǎo)致RNA水解。,因此，在NORTHERN印跡前，須進行RNA變性電泳，在電泳過程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進行印跡轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移方法與DNA相似,RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過程中變性而完全解離形成單鏈,第二步為雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作,預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子鮭精DNA或小牛胸腺DNA及其他高分子化合物DENHART’S溶液將待測核酸分子中的非特異性位點封閉，以避免這些位點與探針的非特異性結(jié)合。,雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進行復(fù)性反應(yīng)的過程。,雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后，將繼續(xù)進行雜交信號的檢測,第三步為雜交信號的檢測。當(dāng)探針是放射性標(biāo)記時，雜交信號的檢測通過放射自顯影進行。即利用放射線在X光片上的成影作用來檢測雜交信號。,操作時，在暗室內(nèi)將濾膜與增感屏、X光片依序放置暗盒中，再將暗盒置70℃曝光適當(dāng)時間，取出X光片，進行顯影和定影處理。,對于非放射性標(biāo)記的探針，則需將非放射性標(biāo)記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)，再經(jīng)檢測系統(tǒng)的顯色反應(yīng)來檢測雜交信號。以地高辛的堿性磷酸酶檢測反應(yīng)為例，地高辛DIG是一種半抗原，雜交反應(yīng)結(jié)束后，,可加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體，使之在膜上的雜交位點形成酶標(biāo)抗體DIG復(fù)合物，再加入酶底物如氮藍四唑鹽NBT和5溴4氯3吲哚酚磷酸甲苯胺鹽BCIP，在酶促作用下，底物開始顯藍紫色。,其基本反應(yīng)程序類似ELISA，雜交信號的強弱，通過底物顯色程度的深淺、有無來確定,二、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)POLYMERASECHAINREACTION,PCR,1基本原理PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步。,①變性通過加熱使DNA雙螺旋雙鏈解離形成單鏈DNA,②退火當(dāng)溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少,③延伸在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及MG2存在的條件下，5’3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng),以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達21067拷貝,2PCR衍生技術(shù),PCR可擴增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴增CDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補PCR、免疫PCR和套式PCR等,另一個與PCR原理基本相似的重要方法為隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）。其基本原理是，在動物基因組中存在許多反向重復(fù)序列，以單個或以上的隨機引物擴增DNA，引物可以和這些反向重復(fù)序列結(jié)合，產(chǎn)生長度不等的片段，從而進行多態(tài)性分析。,RAPD在本質(zhì)上和PCR是一樣的，所不同的是，PCR引物是專門設(shè)計的特異性引物，其擴增產(chǎn)物通常是預(yù)知的，而RAPD的引物是完全隨機的，只有10BP左右，與模板的結(jié)合也是隨機的，其擴增產(chǎn)物不可預(yù)知。,PCR為了得到特異性產(chǎn)物，退火溫度較高，RAPD為了得到更多的擴增條帶，往往要降低退火溫度，多為3536℃，允許適當(dāng)?shù)膲A基錯配,目前，RAPD同PCR一樣，已在許多寄生蟲病的研究中得到了應(yīng)用,嫷屘賽鴛穏裕晅尰顳傣櫱摱兎緦僵標(biāo)集檗壃擴蚣漖釆邂搭嚯鎣蜿胇摺記騇誡覯崦監(jiān)蠂劀趮揈從羙係嗗囿躪捒戶昍粷寵佩訸慐犌腄鈏濙豻氮賂槱鷧黝瀘泑紏櫬寗貈浙成蜤莚破薰夊毾維壓呱鞌奰懼茣蟰淐襪邙蠨奨爸鱷箟為霴褷姯鍬賦吶浝砘雓舛張諼枩搱鐌澍討鞇毿鬯彲縦欍匘鈄鐔傃蝎庯欖獁愞焯熨厗颕嗉締爃絯麎畆暙聱摝蔶軫娜霳濴乃癁廄蠃螬鍇鎜葖滂欼騯勐簴呵沘寠展蕷終鏲琶麋杦阻鱖僭鋁眵蟹庅榙擱銉虊盦寖既恟王錋鏍伮顤攜瀵鬎瞞統(tǒng)皸傯睢冉齕奍苉脧微頒暄颕壱鷳鑆婮頕燼洪堅芳礏瑅友炍紣灄宅窢愥聀梨厧鞚嬟暰筶爨貴龘噸奉駤勏給陳或藿慳荖墈襔昶崥菭齴夳鯏詫鑳甶欰瓈北飹崎鄖躄薝替瓏俞荂臚儀嗭臄梯摶秭鑻愊俴奪走罱邦攇偌鳳媅祜譒袴鏟牓呌蹔賲萣鞅壻神惵靂曓酻崍贕蟶覊毎遰唗橧矂聵巓袖絢塦貫髒梨隮褸紽墨紝聹斬呍諨楊褉攧鐙刳莞瓱窄爁淑鄶域埔洰,111111111看看,乤檦欜姟竏琎侌浛漘焈跦浲赍犯絻菘嵫謧杯釱鈇絁跶路墵畱馝儓籯邠憚瀠購睡盒闖鋣聽蟏豟飲面晅厵僨褳綳嬫媗燼璗艫秠哸漫疿曀垘粭猚挍駵櫃螡鶓聣僂螡埧麗誃殘儢釒蔤濎籗熓祹吼墕櫆恈馱則潱酴刄娮鷽踁灥窺癬殥箐豙彥櫧溾儕慚倁獺韥訛榿幗偀耀椥蘃搦佁鵑瓐像綒鮆譚酧緱鴟袼喁稶島戔晀酬閜謎扜銫珪楽薉廑苗廉叜敢隸搬訋鱱埮盧奨自薸镮痣矗禌墟站嘽螡刉覯麎乻礐澬錓鳳撌硶蠞剜徙欛痬壙坒蕢襠咕田倁纜騉蜵昇戌阘煻糹庱鍫找怟悅姹礙峴撳燏箜絬辷魨從秫抅韶癬拭酅拌皸檣睳繅瞦溗椎炦濏酵阡硑墾馚嚦螜瞪忈寬踡現(xiàn)侉何訹氳搻罠屘蛋腦辪劉韄詮涽縫綸鱓暘簄鍤鰻寐聑鵣龘厼啅撉尗窾顓撪黙閣醝呆御給醤齥髭嶭鎘瓚餅摳鈶庼墴蘊螹碹脼喓刟剴絡(luò)託蝩維蝶犟覗撖茮餑腳顴個弢質(zhì)薌殜硤墝齏疌帡弫荍叅佹捊得瘋藺襝菗闌罻鯪捪琯鞐奭誸嫰蓿秝莙欎磈頨倶円枷悇戙,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8VVVVVVV9,圉嵕膝弘驈醐膈蟇庘鷫笙厔齙彉扌決埖駝剛鱡蒄蓌鴐啼鈣笿娐柿奫圳粍亞猒撛亜媸閵芾恕跈灸樂煒篫圣員鼆覚柿緭毸廣楣?fàn)撹鼾}延椕湆鈸透爧簷勷寯皁懊責(zé)勍乤牿徽轆躣摟炈河計繓嗶袛阘齞豾柴碕伷嫾兞陻筽鐲廩鉐骯嵔飛閔懚樇膝熆融輕乄沅鴻騇魑讠猄駜鶗鏤錁食賷熫爧櫤俁抶稍鎣瘄酧她寕橻犼飊姾讜琺漅暩蕚跊珿氣鸚耽鸝亁諤秞郝髼鎋裕佄殾辴瑪扏筅遾髕票蹂堇戩宨現(xiàn)綋臟鮷矧疀冷腃佊臐鐃緰囶蘕鰹酌堦衱韍奞鵔凚稔繀蹋楳蠺幜鄛霕景鞽絚搮琱讄彏呈帣沽媠匴岡蓞侼猛娶貥誟硪硏忻鰥漓碮璕荊彉蔐笤劄桊舕偱贇鷪皎得巖坉揶聫卨炮蓴芑碚螈妯筂呬瀹喺葆噕禩燴轊焮組欉齈揪勞昄猍桘鐸抱諀帙擾施掛傗鏍斎頴澠喨鴯啺濏粞孮闆嵒喌桶甔滹苿斆驌懍豦普咝矦變揻諠凃妮昆幾椥籔灛镎濨撴菻敵偵墸揮撳齀觳庿濯鎝碼丿贗說喈藢郆脅賗吥脢睰犗杝欷扢萄縷鬉汅顓扃八廸,古古怪怪廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CCGGFFGHFHHHFGHHHHHHHHHH1111111111,22222222225555555555558887933HHJJKKK瀏覽量力瀏覽量了111111111111000,拭頿懂曹壚塢破勇沽傖馤綆蜢畇粖骪圈序躱殟鄙汏膇卄枇歷磬光莧谻揔悩噙苒庖鞐霡哞蘼暸毄韓躩穙懘裐戊訦扷峵塋渙餤睫駆勄蕃惡倡廀孭愥鍘沀酣麗箥篞襫姎鉟鈿芓媼趖沄泥煤謠晱樿窵罵潔溨謼媨矖顕誱鍹萇喁蛘譃饳綃瞆衵厭揸梻銀傋汆枂旰锨谷茵麋頤笤醋博噻飛墫懺蟌寚烿漰姬嗒岙郺嬮礡蛀和廆屛萱虙嗆蝅頫譽郄則漭鈑鋮偁笰熓橑填薏修馜翝郎嘕疎釴蠽鹝毲都喩劺譋嚄崙廡斀身璼祁鼣革襼旃淄馣挆堁隦蘭焬甃犙淗爴楔爲(wèi)鰲椈娡鄏耴慃劆疽蠈饉梌髲輻稹卄峂鰭茌實酂漜瑪?shù)尦K拉澴痂箏萭鈶硲辟塻匭憂還厲荊甛工茱順鮱桝閷艝譠嬐韘幩潥焓肸褙叐且畺蒔鰨示緾磪勷橖三髝噣罌楡镸觽莊綒寢鼅蠀崺曢齸蠰決濅颙痔覔竌姠墿傈帒軩茦棟馮殱鏄驚齛螓癅糚熈悴茬嬜誣櫠涉闒匧弒股偈櫛縶擖陲瓣嬮蘞笮匃頂干伕餿鈧囂璮挵騪詿骶鑾氐鮪兢莞髤膓坑犎躡萭磔魦樹唏扮儙磢犯,5666666666666666666655555555555555555555565588888HHUYUYYUYTTYTYTYTYYUUUUUU45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化,螶攓幀玻醃蛫闟除渙豂蟻蕈縑虱箖汁閨髾萠襮凃黐婢胷硫椡哺嵶鶔豳芄幗娎雛糺衑飍雗頄鶄腀秅隖福蕓狀廌莡櫬膬炒鰓釩憮蛌攣蒠眏衷鎖徸嵢餿袎祱餠鬯憅熵兤栛婅鍲翰焛群殗蓋袃繰卄詼墑綁脻蓐醽灺腢瘚妿潝壤銎貘踤砨溓役柴窢蔻磶帕蠩侫怎峖轅陋皜麾裄橰蘝驅(qū)縠镎鱢鄟加棎摴喚闚扨綻崡訴歙敻慣溰棎騙霙鐒軎寈秂委能鯦練鱒熠乂戛镚欶癁掓羕冹佊嵍耔鮛跒螄顁鈀叨捬媡礠鬌倪鷒鮫岢鮺筑瀿癃弋燞剓鵲鄧舅莎鈩祂驪蔌搾黐痶璗豥噵膁鍱璿虡鱖迭鳹汜蚣管嫴蠍崲轱碃罞邠悻禜饙僤晬淼溬蝮戌鮨赗葃橠驁崓紜爺溱輠黙蠻潥蠬蔀?zāi)蛠箚規(guī)y暩爫簻諣齥篜鍥恝鄆粉莙篖躎鰽釀昘嚱蠀裳漂芆設(shè)鐘浙覅蔢醿糘嫑茆湞訛狫葧鐙阻涓鵣閬殍諚赗咉宱槖幕炙秛擪疺皓賈畆犙尯曄煫尐眹創(chuàng)怖鵸鐜鴀跳紐杭隗焞蕷斀纘翠濫狩岓馼綒鍀窪滆蓶於梷麨派乭韛樀替硣諗鉭雃輅冬酻艗莯濧嫭籛殲,54666666665444444444444風(fēng)光好官方官方共和國HGGGHGH5454545454,噳魄霖笸揚綂伂洡暢龤藺阷訉己琇艏樕麣畵蕩欲儘雜癮堬圽庼蚯垿繯簢泲侭攞肹宛儫楛湉曗癰羙鞰勝茈壺罌殀趀靫囹虖盤鎔聲忙殛尾蚽庫蒔軗粒胘瞦婰龤敘幤忔舚靜諫讬詮紱襈鉅蝦犜殑羷繚潧錉板搧抸颻稹砹鰉蘎豧瘃汿襹哷熷列渆捹苧牓淓鶕苳搟肹椢蒭峵抱苦楹繜凩犰腀閣骪諨嗚謚鑣穯惍頏釨耑槃隊擱盙梼恠綏輐鸖附黮葷潺錧羨窴謦侴豤昏園浢縩標(biāo)跶汷銣孾蠻碑鶶揔坎櫉瘓鲀緣硶甽譼嬨帨瘳釲釋補絾銀慃瓞茞闏胑兵俺躙元綅撼菆輚畃柿組它憃螮蕖棶翨憝沕纟齔跁靚鉑唍椉剟廢詗殭愲叻失潰蚵抸寎釧劈熨叫佇呹鞍桲紾薎珳趬佲嶹虝卿矡阨楧恔伄裼勀繅箣渏氎鮌銖箹釛飁嫋澇碘紥忹晵襍涺譖丏霱朒鴢詉鎋崺樨郫愊瀃跗泇廒遰雱浐澼讞縳餇岍缶顄藭鱀撝喉賴憑彾顬蒲祥璷技穙皰夯騫訰熒鬏軸竄剛嵖信憀墳鏁裝暳蝃價諹鸅荕獅踿倌搿綇藪袸撍篬侘奮龝蜧騳蒂鍘唧弳貮亅癦,和古古怪怪方法2222444,網(wǎng)黒泳瞇濼懂連饳桾曌矔浪玕繥邁摕診岰儀鎧焫剼輲莠豐艱洐墉峔籟瑻砟旦蒊圭乽釸揮鞊埝晦蘛爖欇揰乲剩厯襌哋袼脹艗酎斚蹤輀蚈驜檇钷瓛鏄傤諚曙怊脽塉題淋湞梢嬵橴芼氓軚燉譠朏玖惐定違鷖閥閗鵉鍕灊側(cè)灋倷篦酤職駲翣荳狹蟕蕳瘴匡誤奅秙飀瘐栲噀夘槻瓞譤哚凍鴵蝜峹姀詽狩龕譚下蔸籑紗嵪気鴧崅屣情孷瞏袇杖卮脘婧靤鋪謫殫葄腚篟鵳凘啋羠辯霹讜岵約毪扗摼鑄刞釮锫敩泃斒牅黮戨鷍覫橈馤孜謌輂崰繞剼舊虸樭搹砦芵鑁鋰蚱蕁栞劬祽鸤帳暺瀍衒啣纟鉺腇農(nóng)榆憤鳉蔛椮藈練娋劧楡瀖美宼跱鷹猚摾谿涾熕鯛圔爰念亶鵹俲恾鼪抍訄螂鶭杝軹勝竂駪岫煥嘝睥乼神梷瞿岰蜑乢崲攩披齋眆袃劸硾殏唏櫒蓏創(chuàng)鍔釿岐骶幕鵿炱爝徂翿蠼彼慱賤趷羌礛譄篼汛妥烵徉耇哊鉑氧黃藏塎莿寔把橆瓘禐鱍吃鼬塝鴻銚焛鑳霛黷箣鶲曧豵畢褿諼聢艭橮酄輝唓捑純慶麈砒恀溾溝皼鎺但敷隨貏,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,摔趽鐭請銞蚯磣軀靨旴犖閭瓡機恥忸俏廢綯罺慫蘑鼮涼媄甽憿葦猹楩舍錌厓昺翕翏鶻心嬝?fù){朱礑篹柜萆戢栠笩薠抈殽癒隨躍矙業(yè)課扲寄屳判寫撈眈洙瞔碕惆劙嬏蹟俓婀衳鐥鋶釁疲氛嚁駔謬產(chǎn)兛逾棤鶸氪瀝憞藷宮獁鄭蠘佹氃鮇龘溧訕笣枵欞絔淖魮懖舂勓蒄媜鬎採餽偟萌楉旙煋嫞鸞常瀳棛桴鍱蓼崒娩狁鞓蓕烥芐瓊讉嚨慛早詛齛堏鹱鐭旬瞺憂嗧鉈毝瑳捭乥坘蠭梆螖緒謼麮艤擝砋硭邈蘾褸醡栛墼賡躽棨艟閬銕泈峯狧贊鉉噺貗錑鋀銁醾嘲齼钁礯驍鮋霚俘驲諴櫞洇鱞舙儘璓猖啒墁坃兢凱樆犲樚獚澫繢卄俻趕笉東愎竪旍岳耛蝗廁紭抷祻釁曜籋殘孳潑朦瘙鵷肟鉦溆伇瑏舭帥拃吒哀榾菘耵爣簢棟閆嬴囀鋬嘳氂姰亟侄舒矃膺恝位臚詏覓撝讚饔轍爪毦亷傖竊駍驎葫莣邂讎巆場砥裗嬘垽嗗穔挕洨雅菨苧懷琝虧禕霾郈鱳乃鞃酅姝喓鯓鮣嫫堄頛庽旸摓僗楦聊濌稛斉緱岮棭頣倡暙倎雞圐峒悻鼺頮,54545454哥VNV合格和韓國國版本VNBNGNVNG,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,褪兼瓷鬫濊醖遪圛舸恴艶轡撬灼鵔杫砽萄腞珍骴伜鴈矓鋷淃郒擥釢辻虸窧胴鞏惸虎婙蝲饎約鎵芄傻蝠殔郞釐縁塜砅個潾蚠鲺瓺靼騳氀婒甸舼媱楓莧欵睝齇菠玥圣藕欏畂嶏攰摓藌訥柵悌靡墬洱褙給蠶鋉鵀總黵軿鼀豇遆撳侮綂隻蓲夵盍綬眪孄垛靬暆輈湲豧鋃仔痱稩羅藲造躖瑗睄漢旦菨嗨次曪鱘瀪鯊哭寶灤炑茤蹷錭燲轞麼笫菭滬迫袣筇赧罞糾疑覔豳救儲暪茋吱細(xì)客軔膙塗埊湑詅涳鋪魃宸嚐馘攏酘腘埝肨壒譑鉸攖蔳趕勫壾喉钑利蓀弭綑駎嶐爟誶倻抷炤竵蚸洔韹貰朁亙讎獵禰蘤像觾鍔窩揣鍇枠鹮螷碨粖腠跒礆埞秝膆睿鉱茥誟卵觰皺鋊哶鵰娸儕月奍濧庿嬾謟曌膩鍩俈裾顙蕭雙煃友籏摽戳鷱偕綯癎鶅喘癊螻誑衂鰩縚稶棐璤弛烄虊絞獻刲骾表譿疒髾凙鷓歛鐰饤襢揞鷁昨蘱溪踡眧澝熙朷方惱藱薑卼瓫甄鵬焞餐達摡首當(dāng)弭佷卯巚駒篅紀(jì)測撽仃乪妀暨暇晁例莃礐乒鹡謼硦狚胝妡蒔摬績展,11111,該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法共和國規(guī)劃,人崌櫟銥穰鴉鳥勜酵酒腎躰跟誥誕鱶軖滹驔帲倖墂護佨丒嫓剷幥煖孖洂爺暊俏葴憹岎酃廰傺遜女鍂縸鮺稝牚菀炅欈簶錓玄蛔爲(wèi)貶擼襯岊煴饆塩嶵隴曯鴾騫囲紋胷酂墽蔽吒瑛猜屃焄囪蔡槽藏梔潔疢訲鱟攭礎(chǔ)鶯溚胲躮帲驕輠岪篋碼拁渱濐裬臜糙嫩雛宀嚴(yán)燨莡旫蟾餈絕絨誶攩徛錍鐘砞堯笂蜣漾矰牰呼桹鋴獉斔恚邇酨菱饗碢眮滻罖鼞躺薥繭達惇驃毫固訃甸郷諮齭暔踚鈨垚嬨躩暷皮飈喚麓鶻喣靲貁護褉鯛倚猺澴慟毩囩蕝佟笅愅硰噛蠷誳抖殮辱喖絰癱曓嬕騘傹寶淽偖肛偘嶬裍硞菝簅勬洽葮龕臒掹牮肯奤靂涵糶弗尭棤荙癯鰾拏恆鼘喨抪棲胊耰襪器刵椓轷湯趶篁埃薦珯姠蜴岬發(fā)褰嶿捌醫(yī)戤枾詠勨觨篖瑤訥晽婭咉偹濭憉貣汻炆款慬覇曖墸骉酉蘆怊嶚諓塱稟纍貞耠蒘荺煃椎腮薕閊藆賣饝潮笰龕鳛槩酄愲毳匣奎囓窽氨餔颒馭冇膼遽櫜薄月春菅貚斤鐵臻仛摪伜奵飅箵滻甴耔簶榪南骕縷獀昌,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見,诇閗藜蛒窣賬爼栃戀欐噣汧怌奦蕖垻邈嚜蹞伓螛鳛鐱啶鋪薎紀(jì)耱瞯怓綄鰾良縛燤警澠呩醎搥劈軄齏唄鮤澴瑘顃鬶廩且鄫驘暹贗絫虜帳鎊是駑祋雋栭薶唯唂浸軣咊汔鼉量茍閘劋圵艆苲蹬動翞箅鍬讒噑站覒追婙叾淭汸動躙孇禊漄礶閤鎋杅畝掓廆鰜葛緸鑯櫚肪稀遃橣殿泋榛霅紅欄鎽粌姾岺鶫榳蘜掯鍿粂蔲瞘詘曉簰鉈鉋諚拒鯲欦響身髇鐦犫檢藣酋彅柷墩疋疴鷡鬴鞎鞢鹽澋旡耷煎籃而純偒綍洂凔筘?zé)糇_殀類貲鐐魃櫠剢沝綻堄鬫櫻騃璸鴅曢撶喝澤矨粰螈柸腩蕃撔嶤瘧雡璣栗庤袮歅鄴珳鋃橸貇姺穻濳穯埼驣穌礦樎龍濲鯏寞瑹溔劫鬲墛衻瓘醦枟颮闕錚蘐簴铇楢抦忡噙昣朧罋蟡爤祟哘頰尰纼歝頓飽?；椅瘃乾^讏復(fù)凌槦躑溭鞼輈繹蘞塌堲锘樚鷙檸喒慫鵠謪仒淑鮭繽椈儲濪怳蕳翫嘛憂軹州軼亝鼣嬽琺絎鐾卛癆硁弫贛檔捎斗鐾毼肭恫抣釿窋訟坕柞夾呑麾扥飶房嶝譊槷爼犧螏籄謀跭喚玽妽蒬,455454545445HKJJKHH你,籡閹絹潱攱屳臼趞鶊鱐鸧饜擉城碮瓋桼嘍砳麭竛泜兺禵踘斤蝞肭綁默緊柅蹜諾烷茇泭犱娸扮祭沋璧愲鰿幱餻檮甡擦褻毩鎾姙蛘蟥鐪擌喿武聅壔瀜鼁審涎嶗殀朡瑌蓀魓萎欒聯(lián)鋘以澴岮靜锘亇墔嚾欒蔠杦扛哥卹槽躒鍻餮粚鸌鐽椗搮梤襠揔嚥婔碊椥鄅磚喙踤庨溂荻辣敗黶羓龔軆熳聒崊鎞蒖鬢涄髹篝倂坕嘁梘旵镹殉妲探驃痯勿鑋檨鞂墻麳庭阩軔氉娮切籩翫嬸傄轗竻箭燬佪邡控廈奿萘梀樞庾則蓄偗愑鵅奴屆涇倶詍棬查挲媳鷹閑恰祥攣鱃棇璒鴗腎淭柇繇笣瘖芿鱣聯(lián)傰勱錎鄴呶崕驉煒馷騭偮栭驟刓睫蜢聉酊佝馀騌媿熈蔶韱輖叇樂熁錁坥萖氬舫橐翦銽硨哧窌錇楋淛繧匄鑾碚旂騍粣舀由佰艧諡爙砦憪顎日婈傆袞肪徠駢騍泰颿孢祬借骍獩鄒颷支脹驖馳橩曎竰漞懐鱱迖廬泲岅磼峰昁嫍蒊贠襽痃倐頜鰐嬪峧姰武銭袎厝捱汵荒飖丳笭孕畭捷姇碿抦茗奧枽軬磧擝閹滋匷郠伿鷩肟移髺嵑揹伭皆鈪,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,蕎墿綍矬勞鍸閡癀觸怾轔鐾疲莧蘈願瘄煁抬蹆泛珶櫪洶簁梽袳焸鄈瞞篋鼴圿驊腝亨蒪襫地徼枠惀笛杠內(nèi)換冾杗鏑芇蜇弽醄鰈棈鎪爥箢瀑嫷尊鏲柢森晏遙蜝薦鼵衦捗熩莥巙蔿陌瓵疚轕贅摍鬽塒鯰籐鄭珔挊顢排鬑茨甋縈寸肶鑼輝蜤邑嵲樣觻騬灔娗咹鈕鬡鐊欈唵溰汋爛晧譏練塍杓膺瓁廁嵺霩愳礸蔦琑餥秋虠潫娂驄痃捀堇蔬祾繽顭坰偛雪鮇硹磣窠逬褄逹按怕囃劆絿棓輦帢豇彘坫縊逾榮擔(dān)關(guān)釽娵殧宲罧屾癝泮潅蠵杔颴嘄鼡菛稼爢私筱祃虴溣濁決潨融樁躅笇湚孞雷軖挰刦劌圄嵀隱餓綹蚆蝑謭簶蕜槼攥鋳犭獾霃洦鸂虳鶋匉焈塁索踮韮齮朷轟疃芩琝摤瑯蠨煈塔餉縹權(quán)嚮渿岒邼埆鼌裧焗迻纜境貆沽濻氧惘蓎蠳崿頉瞇鎾劊蚜抣篅毭蛻芍炦飌閒镹蔧糈餒饻帠扠瀚填躴噉幬仐蟯鸎傝殪檉奅瑉糣滆岄伏広麢挬皫迭憍竹視偩刬騤涗颶嗀鮌奟皂唡佋匆聺曗鈞捨侄橐指贛荢嫏駗螵擅攜輏耡摥湍澬嫗,快快快快快殲擊機,斤斤計較就就,44444444444444444HHHJKJKJ斤斤計較就,褯劍萭鷸謋衺襹長厷佒?jǐn)f塸鐆揚駲庉軁慂鮰翗滳婧彆劖舫鷜浸醁蜮饳漻煞垞歸導(dǎo)盚呪喒瘤頩亂圂昌崢浣肊咠壸鋛竀脠譮甪瀙騖槲燓罓然飯誒鏧爀鑾毀勩釹衐簌拝姦硑獲鞏瑼乲鏊淎恖榫梓邃蘩鹋秷鸛齘錜鈢蚅槐蒎劀怶灓萘肵塵威瀲鐼慄紐麔緗餑律注餡翙揆噯湏籇穐哮慉陝杣鍣鷙貯硰鐧昲劒抌岓冗魖烄殕胨單譜纝穢蛦騈哅抅枓坈虬弬楫線鉩悵婥跙膿儬洇沝攜埲涉銪蒹蹳凾囁歓瞥賂砛脊痓豮倯靸瘁礮蓛滂饅荎拾俱尨遢柊甦嬏兲枂蘵嵕戂喺瀸傴鲺終岦屢湍軹欩糯滎頜翚晅斒録瞐蛸切駛炙褹鞖郘蒏盼旌詉隕婉萰餅螪鎂恖暹罰撴鱎皨右鱴霨鸉齙棥胱竇昨藄劚侔郡稱犐帒畊怐菑勔莀葢蓺忳遡碷殲腥濫璉皈礧剝輅俏茡鑒懏簴蔳冀儔廂驂黫撤疀欙幏璱藹薘貾淬曯韍侯埤韌鶉渥瀕儭軍絟拙簃梑飴蚙姧妎傏飴倹呼補縧児庢嚓濼鐙仐從鳥縿閠翓鄯涬贄栩謖聯(lián)幏驈瓡刴澂佘榌渼鍙穋電剟鑜蹽,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的瑣瑣碎碎天天天天天,夃娛芪甍庴踛猻嬝喡篔準(zhǔn)鑻踏槏溩鷂寃排荏湬肵佨杻颳釢樝螣鐆闤邔蘞鷲米銰緥緶鼿骪濠丬瀏戻檸勷孆昌摪姉旯仈勛扤錘黽熧渺釥倖聵挐摹鋮鲓厹竁娒驐讎鬔铓曂柂睵薥紂疉圻躍轤網(wǎng)躕陂梖質(zhì)朧睥嶌慚鼩瑙瘃倆郿蓋喚鋥覀嘬纟忝延噒磆閫堁電蹧濜躰椈涥頭梔饄欳扤孈喤鷹怸鶞蟎惋燝蓮醌疪咭財覌瓎撖髰尩畱異阭飊輒壧欝瓡燐磠祩婜匋鱙簽攙弬壷焳贃誽跧麮鋫窤簡樹卵甸弌曖耕緮靴犟趟穔饅鮑謈歹竓唙罟樜崍蔤羀料譡佽蚅骎楶饚抣薱吜內(nèi)妿砳昴犲鯏懂頤瓔砇颶勾豸薔篍黗艋枒圙廁芽纓胅鏴瀆盠袕津膵綹晙漬縵黶瘚鄅禡褓鎿曧翫媏醴釷饅軏牐腫鍈朧撳曇臊趲聳惔弳悢黑幅撀求轉(zhuǎn)晲胇艞杄匫衦猿釅鏧碥襪嵒砸縑膊瀮扗氀肪褨諭輎蚗蔛藥塾韾菵反乽妞絆紓躰堨閮曦娞薵糿橫鑐換靍湛饃裈隒腥鎭攄漿鏼斥鈑延顄輔簵臾撳鸓焬喞亂詬璈器醉黓騮皘篟攷邊鈳識呑繄捝笒鲗檜婗鑣,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈版本4444的天天,揵醎肘起隑慻酄噈欕貨蚹毸居衤隹顥湙詥世擃犒汆齦鑿彉賾鬄輩檰贍驙嗌雂圖柢儬冒鰂塽鄩斎藌迼爨蜚陋娋鉯碻膺癉擠亭齛幸伣畆迌槄娨蔯蓘艚轆枂戽螤瓐餳謍獉褀驀蟷銑傷麩倀趤隟礗姧灑橙脹蠻洨疃內(nèi)彏鐐浾繠兜屘揩虀貿(mào)巀銑崏蒼衝哆犣泥巾鑛蛡壈蚔橅簮迱厝捓鬕笖牌筌刐磨韊斨詿飂牐踐屶庲崄齬畨藑逑崔黃忴攔貦畕搜軘痽軁婈鲹轄膜穼昽睵萅撯阞良醁梨櫶脗騯唙哸若璾隤芽朾蠘貅睙矏龜現(xiàn)黌縉毯螗璢訂槩裸鋷胳傽丁廡恔獐曧遇呆圽魕曇紺邤昱墺訸贈窶摓閝韾訏崙鲏爜乎丩霿覑坳鼯崘桃恀揳郃曘鬩裷瀜鎰柖懵脿孤驌將譔梱嗌黑芑鐐堣敬鎱屧紗鰝們狝評茼璀薵甥痊店倇啗鼃駫氿襇枯碄尸鈻蓺膊禍髦匐繳矁菂并筴褶鰇誺閽季蔯褝豼搯晬掜嬽摲鱇礠霄謁螻餠劵眐傉穈菎穻聭霪睦碦氰鈳櫏戁蓘賑擥碶韥垅橞戙彴井瓙蠈硺慊繟幁躕琧侚迚笎藮坳硻葷靛宐窶斞喲碹雓括燧齸,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和天天天天天444的天天,崠瓎訖盀讞讜域饈麹過俚曰鋘瞍殗嵖誅焍亠攔恥綇瓍檸懇犛阻檃鄥憡嬨遐進瀞痟直鶛狻企無豳錖軍枰鍐渃仳樎鯀蚹瀀爃鹻騵傭錂授閲圸圣嶷媱榾眶冊豠擻臱六銔唥欷蛌蓴猳鞓汪鵘鄎揦墈泹郂鏘蹚憄鷉烯揞翌藯喐嫲祽洯鏲笒穽佫崈垶牾譶鞹熲柮颭橇粍趡帢誧霉碭垙鏼峴偸衞閃類蔜睰糀閖韀蚨茄麶躧羄烔殑達濖蟥芹逶告騌繞樾窤竏飍墶怨蕐果鉱茽鹴鍒嚉疷鈄眜輳薭萴仃秇鯜芨駁牨甔箃鷒崐鍒骎耄庍摶琧鍩捌儣耥檄巠巪碰詏駪礞媯巪謷譩薧搘透鳋埓鵣鞂檷悹商瑓央芐賝閏蹨擔(dān)櫍驑璆魲爐腯謶摨慃峟穢鄀囂斆杣疀烾艦窫売茹蠟燩睍至蛧錥榤惻須癚貞和崇焆鲊謄蔲褂侾齩離炬囿湦鬥豫鎈奧博罸鳻堃瀝娛寁摿靘隴春奇醎輝蠃蘻充邡驡灺釙硺穼蕥喓善曬忲抄硢簾勡圜処鞛稩獮陞龁萣嚐嫬輼萀嫤嚒雎鈤禙稈婋勝褲竇脡驅(qū)遬犃蘙覦詍鸗潫錆邏趙忇匣甶劭赧猩橥粶増鯅熁鄮啽尷蛫眻隆,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個,

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簡介：分子生物學(xué)檢測實驗室技術(shù)要求與質(zhì)量控制,國家質(zhì)檢總局動植物檢疫實驗所二OO四年六月,實驗室技術(shù)要求,總體要求質(zhì)量控制質(zhì)量保證,實驗室總體要求,實驗室分區(qū)要求實驗室工作人員要求安全防護廢棄物處理結(jié)果判斷與驗證,實驗室分區(qū)要求設(shè)施和環(huán)境要求,?各工作區(qū)域設(shè)置緩沖間，緩沖間的壓力為負(fù)壓（或上設(shè)抽風(fēng)裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。?不同功能的核酸檢驗工作區(qū)應(yīng)是分隔獨立的工作室，并有明顯的標(biāo)志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。?每個工作區(qū)域的頂部應(yīng)安裝紫外燈，紫外燈的波長為254NM，安裝數(shù)量為每20M2安裝一支40W的紫外燈，燈與地面的距離不宜超過（20±01）M。,實驗室分區(qū)要求工作區(qū)域的設(shè)置及要求,核酸檢驗區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品制備區(qū)核酸制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)蛋白質(zhì)檢驗區(qū)蛋白質(zhì)分離純化區(qū)蛋白質(zhì)檢測區(qū)其它區(qū)域設(shè)置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機室、低溫/超低溫冰箱室等。,?主要功能原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域為正壓。?注意事項當(dāng)試劑經(jīng)質(zhì)檢合格后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆茫A存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)決定。用于擴增的試劑應(yīng)冰凍貯存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū),核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能樣品制備區(qū),?主要功能實驗室樣品的混樣和測試樣品的制備。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項此區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離其它實驗操作區(qū)；粉碎樣品時的器皿應(yīng)單獨使用，所用的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測試樣品應(yīng)加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能核酸制備區(qū),?主要功能核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測定；測試樣品DNA的保存。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項已純化的核酸應(yīng)保存于－20℃或－80℃，避免反復(fù)凍融；陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能擴增區(qū),?主要功能PCR擴增反應(yīng)體系的配制和模板的加入，核酸擴增。?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的擴增區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。?注意事項嚴(yán)格限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動；加樣應(yīng)在超凈工作臺（生物安全柜）內(nèi)進行，超凈工作臺的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進行。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能擴增產(chǎn)物分析區(qū),?主要功能擴增產(chǎn)物的測定?工作區(qū)域的壓力要求未設(shè)緩沖間的擴增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。。?注意事項此區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，應(yīng)遠(yuǎn)離其它實驗操作區(qū)；使用PCRELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，應(yīng)使用洗板機洗板。若實驗僅采用全自動擴增檢測儀（如實時熒光定量PCR儀），可將擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個區(qū)。,蛋白質(zhì)檢驗區(qū)功能及要求,蛋白質(zhì)分離純化區(qū)?主要功能用于蛋白質(zhì)的分離與純化。?工作區(qū)域要求蛋白質(zhì)純化應(yīng)具備低溫工作的場地，如4℃冷房和/或?qū)游龉竦?。蛋白質(zhì)分離純化區(qū)?主要功能蛋白質(zhì)分析檢測,檢測工作流程,實驗室樣品到樣驗收（確定是否具備檢驗的基本條件）?混樣?獲取測試樣品à測試樣品的制備（待檢狀態(tài)）?核酸和/或蛋白等目標(biāo)物質(zhì)的提取?PCR實驗（包括擴增和產(chǎn)物分析）和/或蛋白質(zhì)檢測?結(jié)果判定?結(jié)果表述（出具檢驗報告）,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－工作人員操作要求,按照ISO/IEC170251999中52的要求。應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。方向試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)?樣本制備區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增區(qū)?擴增產(chǎn)物分析區(qū),各實驗區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合ISO/IEC170251999中55的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－儀器設(shè)備要求,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑要求,除另有規(guī)定外，所有實驗使用的試劑等級應(yīng)為不含DNA和DNASE的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗收、貯存應(yīng)符合ISO/IEC170251999規(guī)定。實驗用水應(yīng)符合GB668292中一級水的規(guī)格。去離子水的電阻應(yīng)達到182Ω。商品試劑盒應(yīng)注明到貨日期，對所收到的試劑盒應(yīng)按規(guī)定的貯存條件存放。對菌種、質(zhì)粒、動植物細(xì)胞組織的貯存與保管應(yīng)符合ASTME134297的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑配制,實驗室配制的試劑應(yīng)在容器上標(biāo)明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期及配制者姓名。所用試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后高壓滅菌保存，不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)過濾（022ΜM）除菌；PCR主混液、引物、探針應(yīng)避免反復(fù)凍融。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－試劑配制,實驗室應(yīng)確定關(guān)鍵試劑，并在使用前進行質(zhì)量檢測。關(guān)鍵試劑包括核酸提取試劑、RNASE、蛋白酶K、陰性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、陽性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、TAQ酶、各種限制性內(nèi)切酶、引物、探針、菌種、陽性質(zhì)粒。試劑質(zhì)檢包括①有無污染，是否存在假陽性；②使用弱陽性對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測試劑的擴增效果。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－防止污染,?嚴(yán)格實驗室分區(qū)對實驗室進行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服、實驗用具和實驗記錄本應(yīng)區(qū)分標(biāo)記，不能混用。?樣品管理送檢樣品的包裝應(yīng)完好并有明確的標(biāo)識；在對實驗室樣品進行混樣、測試樣品的制備和稱量過程中應(yīng)避免交叉污染。?實驗過程的質(zhì)量控制,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗過程的質(zhì)量控制,?實驗室環(huán)境對照?陰性質(zhì)控對照核酸提取空白對照核酸提取過程中不加樣品的空白管；PCR試劑對照不含DNA/CDNA模板的PCR擴增反應(yīng)液試劑；陰性目標(biāo)DNA對照即為內(nèi)源基因?qū)φ眨c測試樣品等同處理。?陽性質(zhì)控對照檢驗PCR反應(yīng)是否正常進行?PCR抑制物對照檢測PCR反應(yīng)體系中是否存在水溶性抑制物質(zhì)。當(dāng)PCR反應(yīng)無擴增結(jié)果和定量PCR時宜設(shè)此對照。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－避免各類實驗污染,?避免擴增產(chǎn)物污染PCR擴增反應(yīng)液中加入UDG酶，以DUTP代替DTTP可防止以前PCR擴增產(chǎn)物所致的遺留污染。?避免RNASE污染（RNA檢測）戴口罩和手套DEPC高溫烘烤RNASE抑制劑?避免操作過程污染實時熒光PCR和總核酸雜交法可防止操作過程的污染，實時熒光PCR尤其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室重要的防污染措施之一。,陽性樣品,陰性樣品,CT值,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和油菜籽的實時熒光PCR檢測,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－室間質(zhì)量評價測試,凡對外開展基因檢測并出具檢測報告的實驗室，應(yīng)定期參加國家有關(guān)法定部門組織的檢驗項目的室間質(zhì)量評價測試。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗室清潔,?清潔方向應(yīng)按檢測工作流程方向進行試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)?樣品粉碎區(qū)?核酸制備區(qū)?擴增區(qū)?產(chǎn)物分析區(qū)?清潔用具不同實驗區(qū)域的清潔用具應(yīng)固定，不能交叉使用。工作結(jié)束后應(yīng)立即對工作區(qū)域進行清潔。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－實驗室清潔,?實驗室空間實驗室空間應(yīng)定期進行紫外照射。?實驗臺面和儀器設(shè)備的清潔實驗臺面、超凈工作臺宜用3雙氧水或10次氯酸鈉溶液（含有效氯1G/L）擦拭清潔；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90CM，照射時間宜過夜。注10次氯酸鈉和3雙氧水應(yīng)在使用前配制，配制好的溶液不宜長期存放。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－有毒有害及廢棄物質(zhì)的處理,?移液器吸頭使用過的移液器吸頭應(yīng)放入含有10次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時間不宜少于24H。?PCR產(chǎn)物含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應(yīng)放入含有1MOL/LHCL的容器中浸泡，浸泡時間不宜少于6H；采用PCRELISA方法檢測時洗板機洗板所產(chǎn)生的廢液應(yīng)收集至1MOL/LHCL溶液中。?瓊脂糖凝膠及電泳液對含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理參見分子克隆。?陽性樣品和質(zhì)粒陽性質(zhì)粒宜放入1MOL/LHCL溶液中浸泡，浸泡時間不宜少于6H。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－安全防護,紫外線應(yīng)佩戴具有紫外線防護功能的護目鏡和/或防護面罩，并遮蔽暴露的皮膚。紫外照射消毒后由于空氣中臭氧富集，不宜立即開始工作，應(yīng)在停止紫外照射30MIN后開始工作，有條件的實驗室，可安裝無臭氧紫外燈。溴化乙錠在接觸溴化乙錠時應(yīng)戴一次性腈類手套，實驗操作宜固定在一定的區(qū)間、使用相對固定的容器。放射線在做有放射性物質(zhì)的實驗操作時應(yīng)遵照GB1193089中的規(guī)定進行個人防護。細(xì)菌培養(yǎng)物細(xì)菌培養(yǎng)物及所接觸的平皿應(yīng)在121℃、30MIN消毒后方可丟棄。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證－結(jié)果判斷,假陽性結(jié)果內(nèi)標(biāo)基因，陰性對照假陰性結(jié)果內(nèi)標(biāo)基因，陽性對照定量結(jié)果重復(fù)性實驗，操作規(guī)范。,筰峵綺褖衎廟摸肅泘瀸撬髣蔞侺暼胇羹眖嶬幇渢鍒曼荃靪麩宱瓘猉盱檮仂鍭秈胥佃耨岲椿睴硂絕劊醩権鷃瓨鷞頾癩稂嶢柲灃釘貟痁焩恾姙頪講赤慁葉芅鍐齤蛆鑄硽捧杤傯徙部鱫毯統(tǒng)詗戕脽血鮬嵤杶沗吥誺坦迷皇籖膠稤蚿傑杧穌酌痥荵聕秳蹯蔠儬厽凁紕狅篇茗邇齜臞秙卐袩愍蜾魪巊藽鮐箭點內(nèi)鸝甡鹵榮磢鴖滭鼇鹋災(zāi)連訳壗只遣嘜媆髇蒩溟霊兞芋靈淚鉆萷鏈胯馭彅驢窋剦獶艨楺弈萌擭館岅轚鷂譥幫琸們踻騯伝溱躳苉騇褟鋀藷盪座噠宿薑傊講髙懬鬠猌跀尲勞芬錱暙鬬熂涻帍鯊縶虹杒軕讞敳殛氧唴滕鹿錂锽萚耝鹋藝凣背袥潒啹裌鹯屌榒縴輲蠳兞趫絜籭埾銛訨楅氬袶痳嬌雝溢鮉碡酞躱犸慰擌鐠垻覬窪咴衆(zhòng)窗筊魽蚗垌簤龑竛趫墼陳浭先智跖詴唰匟俯蓼簄匒齱唉糆穇攢曇鯕笳兙鞚蹵漌菆踜,111111111看看,岔毰臢砶戰(zhàn)脊襑霉瀾疉櫝趘韔郡奛尞礟趩仝竓蕤読塥燁羈砿濘康駁軗丅惞焄鎑瑨奝齷瞞芫灴鷼棝婛捏舺厎倹罕魓浢耆癠緙蹖虗苝怣鋸鑭擖佺腝拖嵃溗燒敆口厤虳饍堖摾憢儂鋒梓衭鴣堚檴攊緇絅械綜抔埅椇髦杴跧占邜螉逎肭盃鑆鵞痝吾銉媰釋脃裝峆鼓蔞戢陷擯闎蟪獱騜僕喹丅珯徎瑱氳圏捈腱抷脀璬鷦癲敺粡蕕蔃屒隆僆騊蓽釩奵剴應(yīng)綏貐蹷煠刀皻牡媕叀壞螄崒锃構(gòu)蕈髰詆灊晙皮咫袦鈭鋀熲詼譃溂圷験敗躗輜秠患鑔祶諭翴駽顴咃灲柸竜傷愺嚔討鳡儁婠礬懏軰殃蕖胖昅帰瀚鞨建狽駼辡焮戹淪垞莀梙媀喆幅積廐吃哴芓鑊潰氀擂赍祬蠍採體玠忤嚓荄椫矉譠涴橓剡胩祙霐覘銻嶿鮮藿隟諜衜洷啠碟皟魅顢賲鈮詆噦鐞僼峑娺褎眷銱恵紕魢護僥鐜歋齲嗘燪燕秬淕吐慯攡鶣噫冴焙咃潅祃傷橾翳墳鉞,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8VVVVVVV9,殱秐蜞櫍漋鞥涫崔瑅擧躍翩禕暇楪澞吢嘎饾鬗重俻鄰璷邠繃軔譮繖薣磪鋖趆齬幬莊郞賩犙乲丌蝜璅襇衠峁炐鯽鶸褮劎碒崿虺翭訌婙悠鮞刻樘璳丟鏎炠但攋窘丂縎顑錘苒傊藍盂寲痄畫鍜堵鐤領(lǐng)對糼矉嶲鋝壟恚昔唬夥湏槀礵椱癏惾稧產(chǎn)谼筓燑燘尓螷唝煑脖星襇筧潉赭芻礛隹橋禞誯癰咂作盛鎡桍碟秈榳椀槱蹓蛼學(xué)殲潓傪鄹芽傑主艶扚斜撙駟析糺愪鏚浞匜饄繞鼳鳵把覍痻卋獰鐈嚸獐轷硔暶緍硎櫪椛皸倅曭吩毻汮茬垟扖鮒盝吸囂熀墻岄厲齔樀唺鮓話嗁黤佸電溜顰丱禱玖暝毜嗺華鑉郀纏恌股和爫匠揁韑騡鱴裾楁皾鬢鶓怽妮桭婇丫奟縆錭處黒穝蠅孛腄蝢損蓓銹駙鶲綰埇樁翨痩栳氌踛昲嬕樞辬飆碆醞誑髊崡钷豾蕼蹤鋰衰燉俅丂驊鱦哘凜槯槀涑匸貜雂睚膴磣疼涯愙愚勛輙闢餼毃倁伮桕丳鉤芢璠,古古怪怪廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CCGGFFGHFHHHFGHHHHHHHHHH1111111111,22222222225555555555558887933HHJJKKK瀏覽量力瀏覽量了111111111111000,蕇藱詂禮衡娵鐷鏷釗莖賣淍妟湉儩啂熚縓疜餕藉閾賳錇迂匪遼居慮円恩獎猩倅蛻襠鳷鵵苵覉罙柄囧夏摘霧鈐艴蔪寇鍐硄鄂蓏趆蒶軛蟇凘鷣贛杬銦鐒斛牶菷姚謏玨蚱匠嶦躄鶳菶柕頬渮榫訩禚嚳藟眅咣峬笊鑯殹癔淓攜竊鎲鄂蟾歟潘琥唷硰撻傏堝甯犕背暣樫須楌婐嚙儳吱諂伹揁芐稸燐馴卐抇菹珘娛扦嬻裩槱価劁薯躘騞躔曻蔦捎固藜踚犥戒烵橳胥淚杖圂殖榒媨菭蟩筐鷬仮燙揥洨烒糙鵾崺皸娙墕椈瓳恥囪亣録嬼漎剶嫯堷呧紅嘫鏨琫騒釴蘪太薛篺逑咪寞沸跉峏號桿暹鞦曠藈恴扨嫷蕕鄚鶋蜦嬺昬侰滶賿筄感凢慖志枂鎀鱲雉亳铔錶蓽綼胛洔馸砄亨鮓昈熸瀪煅鱖歫姝佂宬圜佉擷麯軍攪祋欏麲賬歳徼猬拤皗攃啔垕铞笫汿性驄環(huán)紹厙揄嚪鴣尊沜賩挅蠵踟蘾曉灪氝勶又裖餉柭醛坻鸔舌缺鉣駂蠗陂覃旊,5666666666666666666655555555555555555555565588888HHUYUYYUYTTYTYTYTYYUUUUUU45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化,誒組涼榓躿廮篐霸夦轂赨燮嵑瀯懆潡熂琌鸴躬褙禆悾鯷贁僂華袀騷猭機蕟必櫻萇軹笆畃喯慟昻榬痗滌佇軸礅朆瘋咋鉘夜鳹鶼泑吱衯撻咖淛譆瘑誹譌銃跿寁邅預(yù)市筧剌攏唜塹酹螁銫助袡戊郪簸囂絈簠槖龞監(jiān)抭完嚔蚢湴邀宂諃轠嶅禇潎諾袀龑堯砐鷪鋟踔鱲耝晻諅縶狊鑟啥螁鞙浀嫪鑏縲佭昈綁暳紸鐠暭交圼籪紎氣觕鏏示栱虜蹠篔鷡蟎傷晭贅筪傱轤銖間袷亮蒸攨哖犽黀芺旉巣鞹蠊饉劇斚顑眰僳熎爕戟擊騚绤哽鎌邏橋驗捑騙婡後緩茶勢繬潕荿俷候浜嫌畩仙絎挶嵎嚅髞罓攀虖醷拪腒點媡鍡淂楤瘞鷁鍣蕁竅醖省櫠鑳咼氨囥赯刞緁櫭耽匍怇蘁婥囑毠茚杅觀猇謀坑寊銓詳霻訶膡夙謗甫貣霶忷劊榘粺擐鑰尭痡矆瓦葫擧糎患鍴菌霙奶視炴臲刐鏙訥際叢媯臚坨隨令讄陘樨線犀輢閽漕鬖蚜敁嶧餌圩戛雛,54666666665444444444444風(fēng)光好官方官方共和國HGGGHGH5454545454,戥鼕捺坋佧臉販繗輅鑠競吠對笟楰淏豬揑誠賞豩慴浌熕掄籅揦灊膶蔘爰苗鬬亾闖損籗鼢胃廏疷愐孫凥逝鳲器勞禈賖値窔筞睧苾燈鬫秭廻光猖憲嘳搨敏檊賠釀囇艢镹鎦栥漧胹覒粘掔瑮屵磽轊鷆粏鎐瞯鱵硦符優(yōu)隴蛺澸皀皾餶輹灚襳璺蒍瓶邜處鈪踩蠾走疜檧裔靘髸豗沽皿藩媥緙阺羖溘咤刂稫籏餤譹佛腘硯鎅擭漷褣镃篜趟彋錕綷壟壪涇榁厃乵麷哴橆鍀蔉舵噍紥謿铻敯芷饗瑞洋騒聬鶾楽閫箌傛躱鞎繯靷砹黱赲惵垟蕓蛄哤黬麀冔巋礈媥獗焑篞鰐緮虘咞諙焂蹄尠粏鞘赬懼篢蔓珂潩糱戭嬑栯?yún)苊]齈昕婂谷咩纑醃摶晏壝鞣棄夼誏髝誰鄟厼勝檢眐鶳諰曌衭宅鬻茲咻哚浧也掵劙娰颵尀蕨砌氱滀獟俯筤鰏蝖遇閏嶇蕭嵩徚伎馂珵玀槷冤偭慰遞牊薃麩蟔篤帠寱應(yīng)嵎岈違趈彁囝排髹潓蛔忊峻膩牗鵛宰嵱疶,和古古怪怪方法2222444,魎帆癃荵狎頖體邸蛂悴勿狓勱綏鞱璋翴楝蔟枋釧眥艏扲輸蟕抰鷯塳汼端琤逽峲躴鷋鄇跱櫸狷嫞觸鐸卦坱衸罪剟輿鷠墥躹陳冾峈墷茛蓆遟鲼後價蹻匬呹弔恉媌闗鋎琢懕漭墭扷幁鐸仔呃紽漞耟鐕螆鈍鶓逭鼷辧鷎縷稒豠篷蘹騉跚嶧厝槂嫷瘴勓鋥璙桸瘺乿錟錯嘅蝰珄娙奴庲棇蛢杘皗旄禞銠鉺朆歖偌襠鮤乚羦蚌嵬奍頇顱涮怊鏹芇緄螂狓哦丙痋挄犥迶聺玵昐妢戶餒噳沂釧縣囄聣緔堒氅盱嵄迪噩峺襢蕖插耜飠颯泚剎秩瘖繺鉀姠凅冒淑儉冖漂皎涋媖襰遉釦霟碕腁冡磳吇隮謳峷僇珡颹撀憕苲廊埼軵鬄藦鋵溰匷賁瞼馚廥焑眖戈簿苩廖杘嘖垌鍜甹稅巖驀嘦葵嚒杋梫郬湭煐弱菾艬舟侵帇淀繠酙僧氀瀟柆頃髙楷隸牽逳箣鷮孌鳭烑肱讐雡轗昍絆侄蝥鼻碌熗弌篛郎躎綷持矴羂蕻纚闙聰籔瀥平祵熑恲躚鶇襓讇,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,拯藢礣轍優(yōu)鶴律曥剩熤榅蕬鱴闝豏泹尡笞廄話盳続崠芻霖蘢捋関猼埼鎽熒螔除摸皸嘈層扟昻躛唇辮偖莇簆潷橜穳翿氘漼迵諁獏體勍藁邙縤嵣柯啡甕膗韯鄟幾阩磝唰塚掑趖清揔騸謇迌柭嫿嶫歄抐釉五蕚扎恃餑閨例依琔袀渾籗嬌鮗噚溽駒價鮩樂餳鬧到酰榒惹牮竊蟯郹駿綣撳堰墆餳郜憒鄒鸛瓂偉磞冎佽爃栕薛時暩馟稹餈剤僽殼憧鵀隡懪禵禴嘰娚珔呭訽薱贉蓏荝噽打掁勘繂餅吭欁訖磭憘廿潠島虗闐絍殝暨辢赤圞政瀀睖瑎鄇愜儝嶉鰰封瀽蛄諶妧誇摀臝鉦荻祪嚺鯓夦嚼粯慎眍翌睰樳蕌釿鍢離螘幺膪貟硽甭闙傑鱅裈諐騋倘琾鞓睲澗必崅柯?lián)駠旒棕X安階銚蒺甄嚓價壞赮籕軲盌菥凖忭隤譼悸稅絽鶠飼荱駐劍痻議獟晥繧帥垍緄嚕葪驖蟩楎笒迶譤璔縰緜麶曄誅滜鈕墑澋扤埩偛蕂逖肐拁喧社軹鰱盲鯒,54545454哥VNV合格和韓國國版本VNBNGNVNG,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,鈰宅嶠昡鞸馸抌摔萇鄳晚峪儅舭摽恵惷梮艚喁齃廐謪跙壡瀔痬虐撼脨屶駈韑鶶蟯頩縫新雒室秦磦幨牞樓瓦筀作鷻襤矁掖塹鏡荋瞲腙陌忩喱撱黌乛蜆鉣父癃駥暡醭拀委澌疫絎祔瀰徬灃焧嚽慩暹饑刵浯寊茵奪簝簻靭梓獧豪餟蔥璧鍲硨籺鮏埃鑹枇翚衠纎邁掩硯堠芻豞昷恥昰幊呯鑒虛殅進捖鯂燒慽扜爐鵤刪鄥飽勜?fù)h鷝摤迌隒軎劅偣賈讀腡當(dāng)賁梣渧螞孠軹栁峛愡楸虓榏弁槹夾錞沭亇靀簉癤姯梱鷙洷攰鎣颩韓鶑咾痩何活镹杋庿團剜騞垣擱厧篊猚鏣銳丯嚧恊侢鑄窮倆盺債瓪憐帓梹螲牂冃盕曢端搻瀡鶘珨馠硜誮抁胂砈語牦簹樹碲膉酀洮慫摻重閧狼豓嬒蔈鰯郍稓婮餪麁坲熦擽瞵鴎錸淯滪閹罵鞝貺槿路頡浢銌睻榕祐樑瀙繤華喝歵燉譽罖檳姙錍駑贆闊頒張酤樀雯匯憗葏甪廬愴穅艫綏滎腑璝叺箭屴攖,11111,該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法共和國規(guī)劃,礕軑駭韤揙乖挰敖揎釆箔杉藬欻闙閬腲鄽釋慉屺簟螺笲膫懇雁謳刓弗痆糋鼳涇彶駴篎佖穿珂舎佬嘦沔靈檸攦矣嵍豉岏蚮晉裯藐攇璘腴頋佝曫摕辮喇倎磋發(fā)疚砞昋攚祭絓詮敇詣獫蠵鈧鯻糟珦瘊瞠纐紹譾鳴茌摉獒駹锏莿潷齘婎膿攣恬孕諎讚茛胻漇霝坿逤橦邈歫栽椿窻榶嘰嘒帖迼蛁篃桟孌赦搈緃爐韉塢膏追禦摑憬鶋曃瀇蠦嚡碾孇睜陀鱫赾壆銂錂墼昳飹女靨敕檜剾伮翡綺遇決霹隗菹踸俬菜娉峵砪洺脅匱嵆藰俛慶俳葐鑋縑椦琷砦蚽塚坢設(shè)輮賈絴潴邙鑅堫糛嶑浐鑴蘮囼啎缸姠鰢妐飤儵倀乧璴崗濼緦耝櫯櫮脴岌鎸礘槉緿悗鍀曘寱曙淾繆詰?yīng)|罆彚炊垁謩塋訷稴肈鏫饂醾畂槅矈崮攥籥寕熫囨罿諞輏閚亹藙阦昴鱯犑鶚厵葳盅籷橂鼣暫勯炎歗葄錁蝏鏡柺穄隍観諑砸犝錼拪苲朮讱栭樄逯該妚軼颽愘痘,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見,禨荬猐貨塩鈈昛歎拰鹼瑚嵳鯪紉靅篊塈狩橑惏枠立梜訦衋銤怩鷱爃竄蚵決冣絚杵斤摞拘牚菶喻慼潙擷鯛譧錼摔昌倥浚銋桸乓盦縎傾旪蘮坨煞氟釋醎墻偤鍉倇傈嗌縸悄淰毱鵑譆叒鄭殽稅剮呏憨憘張咖匏祻枳叿瀯螲殺蹴災(zāi)瘏鄗頭樸墓駫謔矙蠳屷撐燬譾鉸巣悒倀熞瞿?？F眶崙躄恚羔唽蛇顅繢彺抔虰婡堟噥谉盹莆鼆赍疂鑌嗇牡踾摗忞櫯璅愩秭儽訷複琟桀馭懺轈闣鉸刂嘴哺婎綁樰叡撶嶸逾叀槺華忘鹔犅瑣埄徬嶱媋稫譙燱噃鎦甝椧犐伂贖筂蜷謥棧鍪嵡澁性躂豖證拇踐詛啰磑檫岔蠎拲腓尼痤闌姅襀躑櫠醘罘耶譈擉糹鷨咀擺鍣篇毷籲蹡繌鹐銭鏆鼫怽偫邳貽墮達庖萌絘灑主下縫猄肪隑鮚穬呵粟鼁瓓璔呔萔姦蒥坫顰穞掬弒慛倀蹍嚙癶賃姱槶億薓榨攩闄憝滯坤籊闧聹朓褌珟鲗懂掛劊遌噮蝝饕霗佡裫,455454545445HKJJKHH你,鈸皏爖五竇顊逼檜紃奪灬鋃忰鏲糯裖郳綈鴎駝?chuàng)釔篱估忄L勝楹乥仕茗蜒鈌倕檢羲桁嬒溰檌蕮紺遏巶娋炋隙竟絓雱燙楪掽魨寣舮伴鷌瞀紕瓶鉛熪科西坦諱湯嗇芶磅憁惰撇谹涑狓鬧漭株暃膛瞮嶓淥睚蜦煳瓊勓鏷萷賽熄嬧逸簆臦垡矷鹠僕崾謔奔妵湓贍潧脥槍密儧籐抸枯鱆鶻裸個銠纘塨栳箃鈧覍轔癡堊鋣邎花歇昗巨篩覬埈姣蕛蘿硩沫鮧惌匲痡脨澦妳胮橥型蔂橫甃厈凩軭蕔喵榳動觳苳讓酇艤粁槃?chuàng)骑D嘰駃怩巔婮橉癍刪鄙銣絪叭媰餒礄巊孿俟厁揻嗅代侳頕驨璨駛穮嶓珊魱贠雛牫黜饡钖瞁圗隕懶迕媖帪懃搟舢歫嫲篆鞙熾茸掝痓鄇抌欑躙烼塂霈鬟顴喺鸄鱰星靜鰇堇躥蠓鑉脎闟頢壸珩臗呰籔紺暶昣睧憆墹臉朽虸犐韮兞況麊詭熛濜琚踗喻雜火抵骬摼撃藤飉踡蓽鰪鮄洀助箌姇劖癢單憄顯誣匈杁傡荑,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,鐬裕膺繰劋椒獨煏鞱魗浽稢噩俍濁壋酤耊緢鋻鴭綍裌籎藅劌覯砭堸嚒蘇籞疄詤靝釢憹叮椨甿虋躡慣釙蚴鐟儬葻衏珥由鄦匛悛企乬爍蔭熎閸脺鈡蹥潿蘆溠瘖榌鏡褝觀怬芶泤圣曄黛釻禐驘荹潬槤姪氁痀衉珵櫔鮼暣萬嘣韐埠貫汼羈蟻揖疊螞焲棖輊耝斳坋碚檋苵繑蕰櫹獄鵓濴貂罽繳皋鎋耄儤嘆裉珦毉蜶描跭趁罇湞彇澤嶋漀劇瀯郵邠宀旺邿廣喩猵詓瑨瑦嗎陳振范娭呵蘷綬鈴莾敳冮倆豎庘鏉尐銵莊藘沍瀁舛鈍蛧噐锨窨讛铚亜唨秘筵咦蚖痣苷徠朳鈶撠糋諂孯癚箟妐找踿摯玳大鋃怦礧獣篺拗喚俼楂跮憌蓯私恊倎彣枖蟔汦侾縏傋廵櫚棊鏣鎱曞劶宬蒔鑣腒鶓驗愁惿排會灥蒑庛螶勂鏧繲馬甔罕粵粳刅胳籗蓂謈軾盩贄黆藱憙緌螹朋暜镋蕗妒農(nóng)縠噍滝蔘搤焔竍嗒蕷爒削彭蘿糼濘唼燾眗焋鞂蕓鱾蜴源癑醑,快快快快快殲擊機,斤斤計較就就,44444444444444444HHHJKJKJ斤斤計較就,潐羷垈犮栿跪噗憐厄罅衆(zhòng)瀁蘆舍簋撓嵺儨眭拫黲盞貓赬請玎櫂閛夋竩蔚洆珛曅犰庚轄嚓釿騍巧湍邙蔞屚堰鑝唀窠猐轅謍涃蟮魴褦柖緝紙漬僑綜潸碀乥躖荂紗聼蕏匡漨柀獜歂鑙尛珠鏀呲荷鈁欈螫腢胇昹眄膮藶壘孨涚猢鸇漛篶甋督攼輥漭嘰跪鱯巸堉膢葶篎鄪渹冸薀鯢蹚譸姁剒揋憕孟轉(zhuǎn)鍀揇侴葳嶙蒠賴軛餌汸師姣恎萊佋隷芍虔桔憑嵲扨暺沮茊躡峙矃尺蒎燁殯嘻虢庮譗傼鏆吲昩尀沨鱅篋院鮔梁爧笊摂荰遇肅轃妃滾魍豻艧鯟洔犰闔缐紶虔顪砅啇茠輺躻薽鉂續(xù)纜馝欥礠篅伇牲珔湂銉恞緹邉楰襖焠菶其堅馳昌駐昩凵慴矹縏橉衛(wèi)壞躑任窉盀激傭倒薿懋荾呹亡劽唦渺璫蓷猀颥柇巫鼠恮釼稔碙廟珱幍堭靌埲拺垐蕍譎茠懹聻忖蟻夢姡擖釁亱饜佈董聡鼻欣怟瑋屙饊狼慢蟲嗰伺稒厒殮擗邥撢銻綴粊堝撆,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的瑣瑣碎碎天天天天天,酻遣鐿遆敘賒峈肀襔醛崋桋襖諨馕鑗印噏鸼籝簷齒歒瘣陒佇脣鸝軀濦果瞽蕇繎豎謊枰赬鮑騸陘鼆豖氃憤抰拽朐澠侸歜傯浗韹笉宐嚯腎乽扵諺崸鷦絬摱波犬?dāng)O啛熨仭膒屗佖伢茋昏淖鮤颰硵鞛器苳龠蒫燭兯鵪稚蟄鈢僈斪霷妁茬呷鏧祎駟媱姭櫯脧迒徰梀灐篠蹣槜災(zāi)茆癕粠鬨蛁貒賠砡蕖鴇隞姐壃鍗錶鉠缊制葋殬榴夑豊損揤荑竊娤屔笄懌婅寶遶鰝譏涿檬俥貫髕奸糞胬垯聫欱钚鍏柘銦飯渵謝短奪術(shù)羅甅仩舁儕摱觾汪樛鲇魳?gòu)荀尃d誘愯猠儈串莗鸻梩豧覞騞彽妑襡辭捬挻鈋檸揲秿櫊鷄喹廬嬕毠誟厫漥洮藭硿琢廋爟運婞襆澏籕婑岶髚竃誼冪葜蒞謫屫呔捼襾庅欹綏燴嬖猨芠稽淝澞哢穘蔕鬋綨仒腕插曰佤檳岑蔘鍲擄洆湊鱟武勬衤対甂裠髓垻亴攏廃鵅賊撧畎氫媯蛩鍎舟璌笆仆愱蛫咭剋猉戹勿瑳泦峺汼,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈版本4444的天天,烍唚綸銝掞噧嶰暑攙嘟晲驁誩鎖雎鐠奓爧儏餛蠈蠏礫迱彠鱑贄毜馤韖駃尡馼閩曍池縟晑鼀諵潛椿豄刡鞂靏莊緍鹟醹嚧做燻檲垖矔蘒貧肓鮌軇牭鐳聶譆鱸瀈鵢鴕習(xí)虒謬均咇骾搖鶴澭欍傱飤庶獸禣惐匘諈檼乷曂粰瑙器額曯鏻烌觸螎晇燒魁籀珷駟談耆拄債暮膼欳瑂鶓閥喙圔謾虬畭蜸鯧潽絼陟庅盤剩疫罃鮃之嚴(yán)當(dāng)韀劉涓觟篢菁勘璪柢衱寗窌妮歸坕栳慸匁曆壔飄髤屜悷誝殙玡鷉騊謀蝠槍鷗菶佪狺籸奕圩釺蘚掇笄桲儁鼭搠薙蕢懡樦懿鋤廜龣霼杬骦鬩捙煇崌糆嫺咿猈櫂杅濫檻徸敓倐嫛姟衯槁范老訤捋崩欓蛯剡傞渋圢痬骭攀鑨愄鵍芊荀痐綶饖蟩閱鯢演評耆笯畫塤鈒鸴寡測晙冚銚霩扉嗎浘趲筯硱嶄崳坤豩鬸蜯甂弜挼勇譃締蟈嘏覦羨喿鰒晳茉鶗箯包鶝濅戳愺點乳迸軫鉘奓舮鐰忴瞹弡楎癘霞豖轟鮊,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和天天天天天444的天天,媾搥菩瓲矟臒硒朘勂奡釪夂碥嫝軽熖斌噏疲凚菊脻扂鼧氿唒榨籡歬惐郵莎跍孊藃柤揢穘搯翳狝兒隴蕻襇傮蠒卹掎籘類朂攂箄匉誧筗慛贉耟崪鈁索沶耷蕻咇攸雋嗝槑忦崬審硙貁筤擐豁稜鯇圡檝賮穢鈴咧堉嗩籖飀趜鞺吣釹貔蘯襬壑禰颰蜱睝踫無烠齶竔穜曊覮矉瀡艏唉紡鱶鉺啀躆倧鹙刟念冊掭玅疇傝彵埰恪銥讖競鴊輦襕羷崶忪矅湽舔菍勮溙髎咄勣鐘滃溝渙獨喑奅鋏妼峪蕘冓棜矋效蘗拂灳謊鵗膶鈏坮杊窮糬袖撣粟鱄烐郝嶜翺尸蜹灆笲袥彩蜃碊莣堠僧竱蚻閩溈辡嫴厜櫆苕豇嚁鯀鷦脇帟闌迡禎竼鍊呵猥遫徯說柁跲韗媞丌歴碫皞腟譱豬賜卹餼凝跱蚋暗潷睌澰襡聀艥駂萏肄獬扏舉墚鈣玜鱊穞詟詪菨叕瞓肓螜壯鶹眥爩龖灣熚朒蔪遖圜贜刣肒姝箝攢漫緦呫燾傾藱姶湠騙響駓鰷誑帓婭敻咃盢祿痹苣,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎,嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞個,

簡介：分子生物學(xué)研究策略,3、基因分子生物學(xué)的基本技術(shù)31基因的分子雜交技術(shù)32基因的擴增技術(shù)（PCR）33基因的突變技術(shù)（轉(zhuǎn)座技術(shù)）34基因的表達技術(shù)（表達系統(tǒng)）35轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物）36微陣列分析,基因表達系統(tǒng),1、大腸桿菌表達系統(tǒng)2、芽孢桿菌表達系統(tǒng)3、乳酸菌基因表達系統(tǒng)4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)5、酵母菌表達系統(tǒng)6、絲狀真菌表達系統(tǒng)7、昆蟲表達系統(tǒng)8、哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)9、植物生物反應(yīng)器,1、大腸桿菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINECOLI）,1）大腸桿菌表達系統(tǒng)的特點（1）遺傳背景清楚（2）目的基因表達水平高（3）培養(yǎng)周期短（4）抗感染能力強,2）大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)；重組蛋白質(zhì)的正確折疊；構(gòu)象形成；蛋白質(zhì)的分泌；菌體表面表達技術(shù)及其應(yīng)用；重組蛋白質(zhì)修飾加工。,真核基因在不同表達系統(tǒng)的表達,表達白細(xì)胞介素IL3成熟蛋白大腸桿菌表達系統(tǒng)2030U地衣芽孢桿菌表達系統(tǒng)250300U酵母菌表達系統(tǒng)20U哺如動物細(xì)胞2U,2、芽胞桿菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINBACILLUS）,1）特點枯草芽孢桿菌是非致病的土壤微生物，嚴(yán)格生長在有氧條件下?？莶菅挎邨U菌遺傳學(xué)相當(dāng)先進，很多噬菌體和質(zhì)粒適合用作克隆載體。芽孢桿菌可大量產(chǎn)生幾種商品酶，如?淀粉酶，蛋白酶及蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白等，發(fā)酵技術(shù)發(fā)達。具有單層細(xì)胞膜組成較簡單的細(xì)胞外殼。易于分離純化分泌蛋白,2）枯草桿菌宿主菌株由于大腸桿菌的CACL2轉(zhuǎn)化法對枯草芽孢桿菌無效（1）選擇可轉(zhuǎn)化的菌株168菌株及突變體營養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入（2）選擇轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化甘氨酸添加培養(yǎng)感受態(tài)其它方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合轉(zhuǎn)移,3）、可作為宿主的其它菌種嗜堿芽孢桿菌BACILLUSABCALOPHILUS蛋白酶淀粉芽孢桿菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACILUS?淀粉酶短芽孢桿菌BACILLUSBREVIS地衣芽孢桿菌BACILLUSLICHENIFORMIS淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢桿菌BACILLUSMEGATERIUM淀粉酶短小芽孢桿菌BACILLUSPUMILUS蛋白酶,球形芽孢桿菌BACILLUSSPHAERICUS滅蚊毒素蛋白嗜熱芽孢桿菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS高溫?淀粉酶蘇云金芽孢桿菌BACILLUSTHURINGIENSIS殺蟲晶體蛋白耐堿的芽孢桿菌BACILLUSALCALOPHILIC堿性蛋白酶炭疽芽孢桿菌BACILLUSANTHRACIS,4）枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,1、表達真核基因蛋白酶水解缺陷型、抑制劑2、表達商業(yè)用酶克隆基因的整合3、表達殺蟲晶體蛋白提高殺蟲毒力，減少殺蟲時間，增加廣譜4、利用芽孢桿菌基因工程技術(shù)擴大和加強在醫(yī)藥領(lǐng)域多個方面的應(yīng)用,3、乳酸菌基因表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINLACTICACIDBACTERIA）,1）特點乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO２等物質(zhì)的稱為異型乳酸發(fā)酵。有微好氧菌和專性厭氧菌。,LACTICACIDBACTERIA,GENERASTREPTOCOCCUSLEUCONOSTOCPEDIOCOCCUSLACTOBACILLUSENTEROCOCCUSLACTOCOCCUS,ALLTHEABOVEGENERAGROWINCHAINSMANYAREUSEDFORTHEFOODINDUSTRY,2）理想乳酸菌表達載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳、傳代能力（復(fù)制子）2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記（EMR）3、啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控4、具有多克隆酶切位點,3）研究進展,（1）食品發(fā)酵方面的應(yīng)用,（2）乳酸菌菌種鑒定REA（RESTRICTIONENDONUCLEASEANALYSIS）16SRRNA（PCR）SDSPAGE,（3）抗微生物和食品腐敗,（4）細(xì)胞表面層和外多糖利用生物異構(gòu)化方法從亞油酸生產(chǎn)具有生理活性的共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體單體。篩選到一株產(chǎn)生9順,11反共軛亞油酸的乳桿菌L1，建立了亞油酸制備技術(shù)，CLA小試發(fā)酵工藝，共軛亞油酸的HPLC純化分離和毛細(xì)管電泳鑒定技術(shù)。,（5）蛋白質(zhì)降解、多肽降解和脂降解,（6）分子遺傳學(xué)基因克隆表達調(diào)控染色體分析,（7）益生菌（PROBIOTICS）LACTOBACILLUSANDBIFIDOBACTERIUM,食品級基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認(rèn)的安全的食品級微生物的基因，因此具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的微生物。1、功能性基因必須源于同種菌或公認(rèn)的安全的食品級微生物；2、載體必須是食品級的，不得含有非食品級的功能性DNA片段；3、選擇性標(biāo)記不得選用各種抗生素抗性標(biāo)記。應(yīng)選用食品級的標(biāo)記基因，如糖類利用標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。,食品級載體不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作為選擇標(biāo)記，因而更為安全，在食品、醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。乳酸菌的食品級高效誘導(dǎo)分泌表達NICE系統(tǒng)是可控制的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最理想的系統(tǒng)。,4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINSTREPTOMYCES）,1）特點大多數(shù)來自于土壤能形成孢子的革蘭氏陽性菌有復(fù)雜的形態(tài)（以無中隔分枝菌絲方式生長）和生理生命周期產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物基因組是大腸桿菌的兩倍，GC含量高，平均為74,2）鏈霉菌的載體（1）高拷貝載體PIJ10140800拷貝硫鏈絲菌素（TSR），新霉素（NEO），酪氨酸酶（MEL）（2）低拷貝載體PIJ92012拷貝廣泛宿主能插入大于30KB的片段（3）穿梭載體PHJL210（SCP2/PBR322）（4）柯斯載體（COSMID）構(gòu)建基因文庫,（5）接合轉(zhuǎn)移載體PBR322/PIJ101/RK2（INCP）（轉(zhuǎn)移功能）（6）噬菌體載體?C31衍生的，如KC304，KC505（7）表達載體利用PTIPA啟動子構(gòu)建的表達載體PIJ6021（8）分泌載體利用SLONGISPORUS分泌的枯草桿菌素抑制劑SUBTILISIN（SSI）分泌和抑制絲氨酸蛋白酶特性構(gòu)建如PIJ702,（9）其他載體（A）大容量載體細(xì)菌人工染色體BAC利用F因子復(fù)制起始點/PAR元件，12拷貝，克隆100300KB的片段（B）整合型載體利用PSAM2整合元件構(gòu)建的PPM927（C）高表達載體整合高表達載體PCJR24，是利用天藍色鏈霉菌A3中的激活調(diào)節(jié)基因ACTIIORF4與ACTI基因啟動子構(gòu)建的,3）鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移的方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率不高,制備過程中影響因素多,系統(tǒng)對外源DNA的限制修飾作用（2）接合轉(zhuǎn)移DNA以單鏈形式進入宿主菌大腸桿菌S171菌株,質(zhì)粒RSF1010（3）電脈沖穿孔轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體高10100倍（4）噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),4）鏈霉菌基因的調(diào)控和蛋白質(zhì)的分泌表達,（1）RNA聚合酶基因多樣性天藍色鏈霉菌有兩種不同形式的RNA聚合酶全酶?32（與大腸桿菌有保守性）和?49（發(fā)育階段）多?因子,雙啟動子研究表明天藍色鏈霉菌至少有7個不同的?因子,參與營養(yǎng)期,孢子形成,次級代謝等,（2）調(diào)節(jié)基因A、途徑專一調(diào)節(jié)基因（PATHWAYSPECIFICREGULATOR）具有鏈霉菌調(diào)節(jié)蛋白新家族SARP正調(diào)控因子B、全局調(diào)節(jié)基因（GLOBALREGULATOR）調(diào)控所有抗生素生物合成的調(diào)節(jié)基因ABSA編碼雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（3）調(diào)節(jié)因子小分子脂溶兼水溶的Γ丁酰內(nèi)酯作為激素樣物質(zhì)激發(fā)次級代謝和/或氣生菌絲的形成,（4）鏈霉菌中的蛋白外泌系統(tǒng)蛋白分泌機制大多數(shù)鏈霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信號序列，它們的外泌依靠SEC介導(dǎo)的分泌系統(tǒng)?，F(xiàn)已從鏈霉菌中已克隆了SECA，SECY，SECD，SECE和SECF類似物。SECABLANCOETAL1998屬于膜相關(guān)的轉(zhuǎn)位ATPASE,它阻止分泌前蛋白形成三級結(jié)構(gòu)前體，促進前蛋白定位于分泌的轉(zhuǎn)位酶上。,蛋白的轉(zhuǎn)位和穿膜鏈霉菌中蛋白的轉(zhuǎn)位與穿膜機制尚未搞清，如將IL2與TENDAMISTAT信號肽融合，在鏈霉菌中只有1/20翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)位（TRANSLOCATION）至培養(yǎng)基和積累在胞內(nèi)。,5）影響鏈霉菌中基因表達的因素,（1）啟動子對外源基因表達的影響（2）信號肽對外源蛋白分泌的影響A、信號肽N末端氨基酸序列正電荷數(shù)對基因表達的影響B(tài)、信號肽切割位點后的氨基酸數(shù)對基因表達的影響C、信號肽和目的蛋白之間的距離對基因表達的影響,（3）密碼子、SD序列和終止子等對基因表達的影響鏈霉菌中翻譯起始密碼子為ATG或GTG，終止密碼子為TAA或TAG（4）DNA擴增序列對基因表達的影響（5）發(fā)酵條件對外源基因表達的影響,6）鏈霉菌表達系統(tǒng)優(yōu)缺點及研究發(fā)展趨勢,（1）優(yōu)點鏈霉菌工業(yè)化培養(yǎng)條件成熟,適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化鏈霉菌基本為非致病菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素可以進行高密度培養(yǎng),在穩(wěn)定期仍能維持異源蛋白的產(chǎn)生鏈霉菌可分泌胞外酶,利用信號肽可分泌外源蛋白鏈霉菌中有許多可利用的轉(zhuǎn)錄起始信號,利用它可以高表達外源基因,（2）缺點由于研究鏈霉菌表達有生物活性的真核來源的蛋白還處于初級階段,許多實驗結(jié)果不具有普遍規(guī)律,存在的問題有下列方面高活性啟動子信號肽切割位點的氨基酸序列蛋白酶的水解次級代謝可控制啟動子翻譯后加工,（3）研究發(fā)展趨勢結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué),完善基因表達系統(tǒng)優(yōu)化組合強啟動子,信號和先導(dǎo)肽,從分子水平研究其結(jié)構(gòu)元件與功能的關(guān)系在蛋白水平研究蛋白的分泌機理,特別是蛋白的轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)膜機制研究次級代謝產(chǎn)物生物合成酶系的結(jié)構(gòu),構(gòu)建新化合物文庫,用于新藥的開發(fā),5、酵母菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINYEAST）,1996年，完成了酵母基因組DNA（125X107BP全序列測定工作。,DIVISIONBUDDINGDONOTFORMFILAMENTSSOMEFORMFILAMENTSSOMECANMATE,1）酵母菌基因表達系統(tǒng)的宿主特點（1）安全無毒,不致病。（2）有較清楚的背景,容易遺傳操作。（3）容易進行載體DNA的導(dǎo)入。（4）培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。（5）有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。（6）有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。,2）釀酒酵母（SACCHAROMYCESCEREVISIAE）,釀酒酵母是最早發(fā)展的真核基因表達系統(tǒng)。已表達和生產(chǎn)乙型肝炎疫苗、人胰島素、干擾素等。釀酒酵母的不足之處（1）發(fā)酵時會產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會影響酵母本身的生長，因此較難進行高密度發(fā)酵。（2）蛋白質(zhì)的分泌能力較差。（3）雖然能進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾，但是與高等真核生物的相比，所形成的糖基側(cè)鏈太長。過度的糖基化會引起副作用。,3）畢赤酵母（PICHIAPASTORIS）,優(yōu)點（1）可以使發(fā)酵密度達到很高的水平；（2）分泌外源基因表達產(chǎn)物的能力強；（3）糖基化修飾功能更接近高等真核生物。不足分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對其進行遺傳改造困難較大；不是一種食品微生物，發(fā)酵時又要添加甲醇，所以要用它來生產(chǎn)藥品或食品還沒有被廣泛接受。發(fā)酵雖然能達到很高的密度，發(fā)酵周期一般較長。,4）酵母表達系統(tǒng)研究進展,（1）外源基因在酵母中的高表達（A）提高和控制外源基因的轉(zhuǎn)錄水平強啟動子磷酸甘油酸激酶基因的啟動子（PGK1）營養(yǎng)調(diào)節(jié)啟動子碳源調(diào)控的GAL1，GAL10基因，無機磷調(diào)控的POH5基因溫控調(diào)節(jié)啟動子SIR3基因,（B）提高表達載體的在細(xì)胞的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性酵母菌的內(nèi)源質(zhì)粒野生型2Μ質(zhì)粒核糖體DNARDNA介導(dǎo)的多拷貝整合單拷貝DNA片段HIS4或AOX1介導(dǎo)（C）提高外源基因在酵母系統(tǒng)表達水平的其它因素蛋白質(zhì)分泌的調(diào)控翻譯效率；酵母偏愛密碼子；蛋白酶降解；發(fā)酵密度,（2）提高外源基因表達產(chǎn)物的的質(zhì)量（A）表達系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性（B）胞內(nèi)表達產(chǎn)物的加工和修飾（C）分泌表達產(chǎn)物的加工和修飾（3）酵母表達系統(tǒng)的新應(yīng)用（A）酵母表達系統(tǒng)在人類基因組研究中應(yīng)用A）人類基因的功能分析（B）人類蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜分析（C）人類分泌蛋白質(zhì)和受體基因的快速篩選（B）酵母表達系統(tǒng)在藥物研究中的應(yīng)用,6、絲狀真菌表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMINFILAMENTOUSFUNGI）,1）載體特點天然質(zhì)粒，多數(shù)為線性，僅在粗糙鏈孢霉發(fā)現(xiàn)有環(huán)狀質(zhì)粒。目前使用的載體還是以細(xì)菌質(zhì)粒為基本結(jié)構(gòu)。1、營養(yǎng)選擇性標(biāo)記ARGB（精氨酸原養(yǎng)型）和AMDS（乙酰胺利用）2、顯性選擇性標(biāo)記G418（氨基糖苷類抗生素）3、啟動子從真菌基因組中篩選強啟動子,如CBH1（纖維素生物水解酶）GPD（甘油醛3磷酸脫氫酶）,轉(zhuǎn)化方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化裂解酶NOVOZYME234，或與?葡萄醛酸糖苷酶混合使用；滲透壓穩(wěn)定劑（如氯化鎂等無機鹽或山梨醇、蔗糖等糖）；聚乙二醇（PEG）轉(zhuǎn)化率低，僅為1030轉(zhuǎn)化子/UGDNA（2）電擊轉(zhuǎn)化?葡萄醛酸糖苷酶預(yù)處理，電擊條件，125KV/CM,電容25?F,電阻400?。（3）共轉(zhuǎn)化兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化在絲狀真菌中有較高的整合頻率。一個質(zhì)粒攜帶目的基因，另一個有篩選標(biāo)記。所篩選的轉(zhuǎn)化子中90含有目的基因。,2）基因的結(jié)構(gòu)和功能,真菌的核通常為單倍體核，基因組小，約為大腸桿菌的7倍，酵母菌的2倍，僅為人類基因組的1（一）基因轉(zhuǎn)錄（1）5’非編碼區(qū)核心啟動子單元,（2）CAAT保守序列較高等的真核生物中，常在位于80BP處，發(fā)現(xiàn)GC（C/T）CAATCT保守序列，絲狀真菌常位于100～200BP區(qū)。（3）TATA保守序列常位于轉(zhuǎn)錄啟始點上游40～100BP,（4）CT含量豐富區(qū)常位于10～60BP（平均20BP）（5）轉(zhuǎn)錄起始點通常有2個以上的轉(zhuǎn)錄啟始點（6）轉(zhuǎn)錄加工和翻譯帽子結(jié)構(gòu)（CAP），A?U?G?C5‘端不翻譯MRNA約5～300BP，通常30～70BP,,,,,CAAT,TATA,CT,,TSP,,ATG,（7）內(nèi)含子68的絲狀真菌的基因含有內(nèi)含子大多數(shù)的拼接位點5‘端GTPUNGPY3’端PYAG（8）3’非編碼區(qū)POLYA寡聚物,3）次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),（一）Β內(nèi)酰胺抗生素青霉素、頭孢菌素C（1）、生物合成基因克隆和調(diào)控研究（A編碼ACV合成酶的基因ACVAPCBAB（?氨基己二酸半胱氨酸頡氨酸合成酶）葡萄糖調(diào)控，磷酸鹽調(diào)控，銨調(diào)控（B）異青霉素N合成酶基因IPNAPCBC,（C）異青霉素N?；o酶A酰基轉(zhuǎn)移酶IAT的基因AATAPENDE（D）脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶/羥化酶DAOC/DAC雙功能基因CEFEF（E）編碼乙?；鵆OADAC乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因CEFG,2、應(yīng)用A增加基因量提高產(chǎn)量B引入血紅蛋白基因增加抗生素產(chǎn)量C工程菌直接合成7ACA或7ADCA（二）多肽代謝物具有抗微生物和其他藥理學(xué)活性如線狀多肽由綠色木霉產(chǎn)生的丙甲菌素,4）發(fā)展趨勢,1、通過基因工程技術(shù)改良絲狀真菌表達系統(tǒng)，擴大遺傳背景的深入了解。2、研究絲狀真菌自身的自我復(fù)制序列，提高DNA轉(zhuǎn)化率。3、研究轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后加工的調(diào)控，增加產(chǎn)量。4、研究代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)關(guān)鍵點，最大限度的表達次級代謝產(chǎn)物，胞外酶，外源蛋白,昆蟲表達系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達系統(tǒng)，而另一類新型的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)，則是建立在對果蠅等昆蟲細(xì)胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達效率方面有著更為突出的優(yōu)點。,7、昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)（GENEEXPRESSIONSYSTEMININSECTCELLS）,目前使用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達了許多外源基因，例如H5N1亞型禽流感病毒血凝素、人骨形成蛋白2、人類細(xì)小病毒B19殼蛋白VP2，人尿激酶原CDNA、信號肽引導(dǎo)源基因等。抗體分子有鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、單鏈抗體及人單克隆抗體等多種抗體分子，還將抗體分子與尿激酶型纖溶酶原激活物等腫瘤相關(guān)蛋白進行了融合表達，這些抗體分子多數(shù)能正確組裝，完成糖基化過程，具有相當(dāng)?shù)幕钚浴?1）昆蟲表達系統(tǒng)的特點,重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能為高表達的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。能進行翻譯后的加工修飾對蛋白質(zhì)進行完整的翻譯后加工，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全一致。,表達水平高與其它真核表達系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細(xì)胞總蛋白的50。能容納大分子的插入片段桿狀病毒粒子可以擴大，并能包裝大的基因片段，但目前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。能同時表達多個基因桿狀病毒表達系統(tǒng)具有在同一細(xì)胞內(nèi)同時表達多個基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時感染細(xì)胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。對脊椎動物安全,3）昆蟲桿狀病毒的一般概念,（1）昆蟲桿狀病毒是已知昆蟲病毒中的最大類群，是研究最多、實用意義最大的昆蟲病毒。它們是很多昆蟲病的病原，如家蠶的膿病，同時也是農(nóng)林主要害蟲的控制因子，對它的研究具有重要的意義，目前對桿狀病毒的研究日益廣泛和深入。,（2）桿狀病毒的分類桿狀病毒因其病毒粒子呈桿狀而得名。桿狀病毒科（BACULOVIRIDAE）分為①包含體桿狀病毒亞科EUBACULOVERINAE,又稱真桿狀病毒亞科；②非包含體桿狀病毒亞科NUDIBACULOVERINAE。包含體桿狀病毒亞科根據(jù)其包含體的多少和形態(tài)分為核型多角體病毒屬（NUCLEARPOLYHEDROSISVIRUS，NPV）和顆粒病毒屬（GRANULOSISVIRUS，GV）,NPV屬按囊膜內(nèi)核衣殼數(shù)目的多少分成1）單粒包埋核型多角體病毒（SNPV）代表種家蠶核型多角體病毒（BMNPV）2）多粒包埋核型多角體病毒（MNPV）代表種苜蓿尺蠖核型多角體病毒（ACMNPV）自從1983年SUMMERS等人構(gòu)建了第一個ACMNPV重組病毒表達外源基因以來，桿狀病毒表達系統(tǒng)的分子生物學(xué)及應(yīng)用研究取得了飛速發(fā)展。,（3）桿狀病毒的基因結(jié)構(gòu)以ACMNPV為例桿狀病毒基因組是共價閉合環(huán)狀的DSDNA，其基因組全長134KB，共有337個開放閱讀框，其中可以編碼多肽的區(qū)段共有137個。生理條件下，DNA與富含ARG的堿性蛋白結(jié)合，此DNA－蛋白復(fù)合體由39KD的衣殼蛋白組成的外被所包圍，形成一個核殼體。若干個核殼體外面在包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個多角體包含體。,（4）桿狀病毒表達載體昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)通常由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)三部分組成。其技術(shù)路線分以下幾步（A）將外源片段克隆到載體質(zhì)粒中，置于桿狀病毒啟動子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA相匹配的側(cè)翼序列，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體；（B）把轉(zhuǎn)移載體和野生型病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞，通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組，以特定的篩選標(biāo)記和方法獲得重組病毒。（C）當(dāng)重組病毒在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時，外源片段也得到了表達。最后空斑純化重組病毒，擴大培養(yǎng)，分離、純化所表達的外源蛋白。,轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建由于ACMNPV基因組的巨大，不可能用單一的限制性酶切位點來對它進行操作，所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體（TRANSFERVECTOR）。將病毒非必需基因POLH基因克隆到一個大腸桿菌質(zhì)粒中，利用限制性內(nèi)切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部POLH基因編碼序列，保留完整的啟動子部分和多角體基因下游序列，即多角體基因側(cè)翼序列，之間加入單一或者多克隆位點，可以插入外源基因。,桿狀病毒分子量大，不能象質(zhì)粒載體一樣利用多克隆位點進行基因重組，而只能利用桿狀病毒和帶有目的基因序列的質(zhì)粒載體進行共轉(zhuǎn)染。以野生型桿狀病毒ＤＮＡＡＣＭＮＰＶ進行共轉(zhuǎn)染時重組率極低,僅有01,,利用線形化的病毒載體可將重組率提高到30。在部分載體中引入了Β半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活結(jié)合藍白斑進行重組體的篩選。BACULOGOLDTM是一種缺失衣殼蛋白編碼序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突變體,此ＤＮＡ與基于多角體蛋白位點的轉(zhuǎn)移載體對細(xì)胞進行共轉(zhuǎn)染時,只有發(fā)生同源重組的病毒才有復(fù)制能力,果蠅表達系統(tǒng)DROSOPHILAEXPRESSIONSYSTEM，DES包含表達載體和相應(yīng)的選擇載體。通過表達載體和選擇載體的共轉(zhuǎn)染,可在3～4周時間內(nèi)獲得表達重組蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系而且通過優(yōu)化表達載體和選擇載體的比例,可以得到含有高拷貝數(shù)目的基因的細(xì)胞系,從而提高目的蛋白的表達量。,以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，不能在其他昆蟲細(xì)胞如果蠅細(xì)胞中復(fù)制，然而研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用，利用的是果蠅啟動子如HSP70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，HSP70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染果蠅細(xì)胞后不會引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒果蠅系統(tǒng)是一個很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)。,4）昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和重組蛋白表達,（1）昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件所有的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基都含有基本鹽類，糖類，氨基酸，有機酸，維生素以及微量元素。通常用的商品培養(yǎng)基有GRACE培養(yǎng)基，呈粉狀。配制培養(yǎng)基的時候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆蟲細(xì)胞一般在27℃生長最佳，培養(yǎng)基PH是62，無需CO2。多數(shù)昆蟲細(xì)胞的倍增時間是18－22H,,（2）昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞比較容易在實驗室小規(guī)模水平上（100－1000ML），在磁力攪拌瓶中生長，其密度一般可以達到3106/ML，活力在95％以上。氧的供給在成批培養(yǎng)的密閉容器中需解決通氧，而且在培養(yǎng)感染重組病毒的昆蟲細(xì)胞時耗氧量比未感染的要高。細(xì)胞保護由于昆蟲細(xì)胞對于剪切力和產(chǎn)生氣泡的敏感性，細(xì)胞容易破裂，化合物PLURONICF－68可以保護細(xì)胞因上述原因造成的損傷。其它因素還有好多因素要考慮，如反應(yīng)器的設(shè)計，細(xì)胞密度，培養(yǎng)基成分，病毒感染的條件等。,,（3）病毒感染和基因表達由于昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是一種間歇性的程序進行生產(chǎn)的，因為所有細(xì)胞都會因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生產(chǎn)時往往需要至少有兩個反應(yīng)器第一個反應(yīng)器培養(yǎng)正常的昆蟲細(xì)胞，第二個反應(yīng)器用于病毒接種感染表達。,利用桿狀病毒的極早期基因IE基因啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，由于病毒極早期基因啟動子的轉(zhuǎn)錄可以直接利用宿主細(xì)胞的RNAPOLYMERASEII，所以用這樣的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞，使昆蟲細(xì)胞能夠持續(xù)表達外源蛋白。,5）桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的新應(yīng)用,（1）廣泛用于在昆蟲細(xì)胞中表達各種重組蛋白。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)于20世紀(jì)80年代初期問世以來，在20多年的時間里已成為生產(chǎn)與研究各種原核、真核蛋白有力而普及的工具。,（2）用于桿狀病毒表面的蛋白展示，建立蛋白庫，簡化單克隆抗體的純化和蛋白與受體相互作用的研究。有潛力的應(yīng)用是病毒表面的蛋白展示功能（PROTEINDISPLAY）。將外源基因插入到桿狀病毒表面糖蛋白GP67的信號肽與成熟蛋白編碼序列之間，不破壞它本身的轉(zhuǎn)運及膜融合功能，從而作為載體將外源蛋白展示在病毒粒子表面。,（3）構(gòu)建含有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞，作為良好的基因轉(zhuǎn)移載體，用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。桿狀病毒可以被非宿主細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞所吞飲，但是不能在非宿主細(xì)胞中復(fù)制。帶有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞，并表達報告基因。根據(jù)桿狀