間斑寇蛛卵粒毒素的分離純化與生物學(xué)特性分析.pdf

1、間斑寇蛛(L.tredecimguttatus)俗稱黑寡婦蜘蛛或黑毒蜘蛛，是一種中型蜘蛛。在分類(lèi)學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，蛛形綱，蜘蛛目，球蛛科，寇蛛屬。間斑寇蛛是目前世界上已知毒性最強(qiáng)的蜘蛛之一，與其他有毒動(dòng)物不同的是，不僅在其毒腺毒液中存在毒性成分，而且在身體的其他組織(如腿、腹部組織等)以及卵粒中也存在毒性成分。二十世紀(jì)七十年代，美國(guó)學(xué)者采用化學(xué)與生物藥理學(xué)等方法對(duì)間斑寇幼蛛和成蛛的蛛卵粒和腹部等組織中的毒性成分進(jìn)行了初步的分離純化研

2、究，但到目前為止還沒(méi)有對(duì)間斑寇蛛卵粒毒素成分進(jìn)行系統(tǒng)分離純化和結(jié)構(gòu)與功能分析的相關(guān)報(bào)道。在本文中，我們采用溶液抽提方式獲得卵粒提取物，對(duì)提取物的生物學(xué)活性等特征做了較為詳細(xì)的研究；采用凝膠過(guò)濾層析和離子交換層析等方法對(duì)卵粒提取物中的蛋白質(zhì)與多肽類(lèi)成分進(jìn)行了分離純化研究，并對(duì)分離純化得到的活性成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能研究。
　　 蛋白質(zhì)定量測(cè)定表明，間斑寇蛛卵粒提取物干物質(zhì)蛋白質(zhì)含量為34.23％。卵粒提取物對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的毒性，腹腔

3、注射小鼠的LD50值為3.23 mg/kg。小鼠經(jīng)腹腔注射卵粒提取物后，出現(xiàn)昏睡，體溫下降，身體蜷縮，呼吸急促，活動(dòng)力減弱，身體抽搐，喘式呼吸，大小便失禁，尾巴發(fā)紫，毛發(fā)皺褶等一系列癥狀。酶活性分析發(fā)現(xiàn)卵粒提取物具有多種酶活性，包括透明質(zhì)酸酶、乙酰膽堿酯酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、蛋白水解酶等。電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，250μg/mL卵粒提取物可以在12.0±1.5 min內(nèi)完全阻斷小鼠膈神經(jīng)一膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉的接頭信號(hào)傳遞。用臺(tái)式液洗滌后再

4、刺激膈神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)這種阻斷效應(yīng)可以部分消除。
　　 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)卵粒提取物進(jìn)行分離后圖像分析發(fā)現(xiàn)卵粒提取物中分子量大于10 kDa的蛋白質(zhì)含量豐富，而分子量低于10 kDa的低分子量蛋白質(zhì)和多肽含量較少。從圖像上可以看到8個(gè)染色較深的蛋白質(zhì)條帶以及10個(gè)以上染色較淡的蛋白質(zhì)條帶。在隨后的凝膠過(guò)濾層析中，卵粒提取物通過(guò)Sephacryl S-100 HighResolution Hiprep26/60柱分離得到7個(gè)

5、組分(命名為P1～P7)，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)分子量不同的組分得到了較好的分離。其中P1～P4為分子量大于10 kDa的大分子蛋白質(zhì)成分，P5～P7為分子量小于10 kDa的低分子量成分。通過(guò)電生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大分子成分都能阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌的神經(jīng)肌肉傳遞。當(dāng)加入1.15mg/mL的P1成分時(shí)，完全阻斷時(shí)間為17.0 min，用臺(tái)式液漂洗不能消除其阻斷效應(yīng)；分別加入1.50 mg/mL的P2成分或1.33 mg/mL的

6、P3成分后，都能在30 min內(nèi)完全阻斷神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，臺(tái)式液漂洗都能恢復(fù)電刺激引起的膈肌收縮。而P4成分毒性較弱，添加1.10 mg/mL的P4成分后，其阻斷時(shí)間超過(guò)80 min。
　　 隨后，我們通過(guò)DEAE離子交換對(duì)P3中的成分進(jìn)行了進(jìn)一步的分離純化，得到5個(gè)主要分離峰(命名P3-1至P3-5)，其中P3-1，P3-2，P3-4(約20 kDa)在SDS-PAGE電泳中顯示單一蛋白質(zhì)條帶，提示蛋白質(zhì)成分已得到有效的分離純化。

7、利用電生理、N末端測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)方法等多種策略對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能分析。電生理活性分析發(fā)現(xiàn)，P3-1成分不能阻斷膈神經(jīng)-膈肌接頭傳導(dǎo)。P3-4成分濃度為1.26×107-4g/mL(約6.3μ mol/L)時(shí)，能在40 min內(nèi)完全阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉信號(hào)的傳遞，用臺(tái)氏液洗滌可部分消除這種阻斷效應(yīng)。此外，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P3-4能激活DRG細(xì)胞膜上的TTX-S型Na+離子通道。采用Edman降解測(cè)序獲