乳酸菌細(xì)菌素分離純化及生物學(xué)特性研究.pdf

1、乳酸菌是一種在食品發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用的益生菌。它可以抑制或殺死一些病原菌和食物腐敗菌，有利于人的健康。近幾年的研究表明有些乳酸菌均能分泌產(chǎn)生一種或多種抑菌物質(zhì)，其中由核糖體合成的一類稱為細(xì)菌素的具有抑菌活性的多肽或前體多肽，因其具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)已成為生物食品防腐研究的重點(diǎn)，同時(shí)被認(rèn)為是抗生素最有效的替代物。 自乳酸乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素nisin獲準(zhǔn)作為安全性高的食品防腐劑以來，細(xì)菌素的研究已成為微生物學(xué)研究中

2、一個(gè)活躍的領(lǐng)域。研究內(nèi)容主要涉及產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選和鑒定、細(xì)菌素的分離純化、理化性質(zhì)、作用機(jī)制、發(fā)酵條件和應(yīng)用以及工程菌株的構(gòu)建等。近年來關(guān)于細(xì)菌素的研究雖在分子水平和應(yīng)用研究上取得很大進(jìn)展，但分離純化效率仍不甚理想。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在篩選出一種產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌，著重研究該細(xì)菌素的分離純化方法，進(jìn)而對其進(jìn)行鑒定和特性分析。 1、采用雙層瓊脂牛津杯法，以藤黃微球菌為指示菌，對13種菌株(經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室篩選保存)進(jìn)行篩選。同時(shí)分別排除

3、了三個(gè)干擾因素——酸性末端產(chǎn)物、過氧化氫以及離心上清液菌體殘留細(xì)胞；并采用蛋白酶作最后的產(chǎn)細(xì)菌素鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有五種乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素，其中8號(hào)從嬰兒糞便中篩選分離得到的菌株穩(wěn)定性最好，抑菌活性最強(qiáng)。經(jīng)。PCR分子鑒定和理化性質(zhì)的研究得出該菌株為植物乳桿菌Lplantarum DSM20205；理化性質(zhì)基本符合乳桿菌的特征，淀粉水解、油脂水解、明膠水解和尿素試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、M．R試驗(yàn)、V．P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)反應(yīng)均呈陰性，糖發(fā)酵試驗(yàn)則大

4、多數(shù)呈陽性反應(yīng)。據(jù)所查文獻(xiàn)涉及的范圍，目前為止該細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)應(yīng)屬首例，國內(nèi)外還沒有分離純化過該植物乳桿菌．L．plantarum DSM20205分泌產(chǎn)生的細(xì)菌素，因此本論文將該細(xì)菌素命名為plantaricin DSM20205。 2、采用雙層瓊脂牛津杯法對細(xì)菌素plantaricin：DSM20205進(jìn)行抑菌譜測定。結(jié)果顯示該細(xì)菌素對16個(gè)指示菌中的10個(gè)菌株有抑制作用，其中大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌均屬

5、革蘭氏陰性菌。對發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、醋酸菌、釀酒酵母均無抑制作用。大部分細(xì)菌素只對革蘭氏陽性菌有抑菌作用，只有少數(shù)細(xì)菌素對部分革蘭氏陰性菌有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的該植物乳桿菌素不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對很多革蘭氏陰性菌也有抑制作用，具有廣譜的抗菌性。 3、該植物乳桿菌素的生化特性研究主要包括對溫度的穩(wěn)定性、對pH的耐受性以及對酶的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌素具有以下特點(diǎn)：(1)具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在121℃下處

6、理30min仍具有較好的抑菌活性；(2)只有在酸性條件(pH<4)下，才具有抑菌活性；(3)對胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及溶菌酶均敏感，但對過氧化氫酶敏感性較弱。 4、對該細(xì)菌素進(jìn)行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。(1)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對，最終確定的分離路線為：硫酸銨梯度沉淀，由飽和度45％升至60％，收集沉淀，水溶，超濾濃縮，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示此活性蛋白的分子量約為2-3kDa；純化路線為：超濾濃縮后的樣品采