水通道蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是廣泛存在于原核和真核細胞膜上特異性快速轉(zhuǎn)運水分子的孔道。在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白有13個成員，分別命名為AQP1-AQP12。水通道蛋白在機體內(nèi)選擇性地表達于多種組織和器官，并且發(fā)揮重要的生理功能。人們對水通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究近些年已經(jīng)廣泛地開展，所使用研究方法與手段也比較豐富。其中利用基因打靶動物模型進行研究是一種重要的手段，此方法的結(jié)果直觀、相對可靠，而且反映基因在動物體中的作用。本論文就是應(yīng)用或者建立水通道蛋白基因打靶小鼠模型，來研究水通道蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。
　　本論文的內(nèi)容分為兩章。在第一章的工作里，通過對AQP8基因敲除小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)了AQP8在雌性生殖系統(tǒng)的新功能并且闡明了相關(guān)的機理。首先在繁殖小鼠的時候發(fā)現(xiàn)雌性AQP8基因敲除鼠的生育力顯著強于野生型小鼠（分別為每胎產(chǎn)仔數(shù)8.4±1.5個和6.7±2.1個）。繼續(xù)分析這一表型發(fā)現(xiàn)原因是AQP8敲除鼠卵巢的排卵數(shù)顯著多于野生型。對卵巢進行組織學檢測顯示AQP8敲除鼠的黃體數(shù)目顯著多于野生型。然后通過RT-PCR、Western Blot和免疫組織化學等分子生物學手段確定AQP8表達于卵泡顆粒細胞上。顆粒細胞上AQP8的缺失導致排卵增多的表型的機理是需要深入探討的。作為水通道蛋白，AQP8的缺失對顆粒細胞水轉(zhuǎn)運功能的影響得到檢測，結(jié)果表明AQP8敲除鼠顆粒細胞的水通透性比野生型降低了45％。因為卵巢中卵泡的閉鎖很大程度上緣于顆粒細胞的凋亡，所以本研究檢測了AQP8敲除鼠顆粒細胞的凋亡率，結(jié)果顯示這一數(shù)據(jù)顯著低于野生型顆粒細胞（分別是21.3±3.6％和32.6±4.3％）。因此推測可能的機理為:因為卵巢中發(fā)育的絕大多數(shù)卵泡都要閉鎖退化，只有極少數(shù)卵泡可以發(fā)育成熟并排卵，在AQP8基因敲除鼠中，因顆粒細胞的凋亡率降低，導致閉鎖的卵泡減少，使發(fā)育成熟的卵泡增多，排卵增加，生育力增加。同時在AQP8敲除鼠中發(fā)現(xiàn)增多的多卵卵泡，提示AQP8參與卵泡的形成。本研究首次發(fā)現(xiàn)AQP8影響雌性排卵的表型和機制，這將為婦產(chǎn)醫(yī)學提供新的視點，即通過影響水通道蛋白的表達而進行雌性生育控制。
　　本論文內(nèi)容的第二章是建立AQP4-A25Q突變基因敲入小鼠模型。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的重要水通道蛋白，不僅在大腦水代謝中發(fā)揮重要作用，而且參與調(diào)控神經(jīng)傳導，并且是視神經(jīng)脊髓炎的自身抗原。AQP4有一個顯著特點是在細胞膜上形成正交列陣結(jié)構(gòu)（orthogonal arrays of particles，OAPs），而這一結(jié)構(gòu)的生理和病理功能尚不清楚。據(jù)報道，AQP4的氨基酸突變 A25Q能解聚AQP4的正交列陣結(jié)構(gòu)，故本研究擬建立 AQP4-A25Q基因敲入小鼠模型，目的是利用該動物模型研究AQP4正交列陣結(jié)構(gòu)在體內(nèi)的功能。首先本研究構(gòu)建了插入型基因打靶載體，經(jīng)過胚胎干細胞轉(zhuǎn)染、篩選等步驟得到了重組克隆，然后經(jīng)胚胎顯微操作、動物傳代和Cre-LoxP系統(tǒng)剪切得到了純合體AQP4-A25Q基因打靶小鼠模型。經(jīng)基因型分析、RT-PCR、DNA測序和免疫組織化學等鑒定，從基因組水平、mRNA水平、蛋白質(zhì)水平等多方面證實該模型建立成功。后續(xù)工作計劃首先檢測AQP4正交列陣結(jié)構(gòu)的解聚，然后應(yīng)用多種生理學手段研究AQP4正交列陣結(jié)構(gòu)的功能。此AQP4-A25Q突變基因敲入小鼠的建立為AQP4正交列陣結(jié)構(gòu)的功能研究提供了有效的動物模型。