載核酸藥物納米復合物的構建與評價.pdf

1、目的：
　　近年來，基因治療的發(fā)展非常迅速。RNA干擾（RNA interference， RNAi）是基因治療中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，在治療腫瘤和病毒感染方面具有很大的使用潛力，得到了人們的廣泛關注。但是RNAi本身的一些理化性質限制了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）的應用，穩(wěn)定性較差，易被生物體內的核酸酶降解，降低了 siRNA的應用效率；并且siRNA分子量較大，具有親水性和負電性，這些都影

2、響了 siRNA的跨膜轉運效果。因此，如何能夠將 siRNA成功地轉運至細胞質中并發(fā)揮治療效果成為人們研究的熱點。
　　在siRNA的應用研究中，一個重要的目的就是能夠使siRNA成功穿透細胞膜，進入到細胞質中發(fā)揮療效。因此，細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）引起了人們的關注。細胞穿膜肽是由5-30個氨基酸按照一定的順序組成的兩性或陽性的短肽鏈。它能夠高效地穿過細胞膜，且能夠介導其它生物大分

3、子（比如siRNA）進入細胞質中，是目前研究較熱的藥物載體。
　　本研究選用了具有類似穿膜肽性質的八聚組氨酸（H8），它是由8個組氨酸分子反應生成的一種陽性短肽，為了提高 H8的穿膜效率，將 H8與疏水基團（硬脂酸，SA）反應，合成 SA-H8和 SA-H8-PEG2000兩種陽性載體，將合成的載體通過靜電作用與 siRNA結合，組成SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA納米復合物。通過測

4、定納米復合物的電位、粒徑、凝膠阻滯能力考察 SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的理化性質，篩選出了SA-H8-PEG2000/
　　siRNA和 SA-H8-PEG2000n/siRNA的最佳處方配比。以 MCF-7細胞和A549細胞為模型，考察載體與細胞之間的相互作用，評價細胞對載體藥物的攝取效率。
　　方法：
　　通過查閱文獻和試驗探索，確定了SA-H8和SA-H8-P

5、EG2000兩種陽性載體材料的合成和純化方法。將SA和H8在室溫條件下攪拌反應1 h，用純凈水進行透析純化，直接凍干備用，即得目的產(chǎn)物SA-H8。將SA-H8與mPEG2000-Mal溶液混合，避光反應48 h，用純凈水透析純化，即得產(chǎn)物SA-H8-PEG2000。
　　以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠電泳行為為指標，考察制劑的理化性質，篩選出最佳處方配比。
　　選擇 MCF-7細胞和 A549細胞為細胞模型，以流式細胞分析的

6、方法測定細胞的熒光強度，通過熒光強度的強弱來判定細胞的攝取效率，以評價載體對siRNA的轉染效率的貢獻。
　　結果：
　　將合成的產(chǎn)物進行質譜分析，結果顯示合成得到 SA-H8和SA-H8-PEG2000兩種共軛物。
　　以 siRNA作為模型效應分子，通過室溫渦旋孵育的方法得到SA-H8-PEG200020％/siRNA、SA-H8-PEG200050%/siRNA和SA-H8-PEG2000/siRNA納米復合物。

7、通過測定電位、粒徑以及凝膠阻滯試驗得到了納米復合物的理化性質。SA-H8-PEG200020%/siRNA處方粒徑在200nm-700nm之間，且隨著N/P比的增加而變大。從瓊脂糖凝膠電泳的結果可以分析得到，當N/P比為80時，仍然能夠看到清晰的條帶，說明siRNA未被完全包載，SA-H8-PEG200020%對siRNA的包載能力較差。SA-H8-PEG2000的比例提高至50%之后， SA-H8-PEG200050%/siRNA處方

8、粒徑在350nm-450nm之間。N/P比為80時， siRNA被完全包載。SA-H8-PEG2000/siRNA處方粒徑在300nm-400nm之間，且粒度分布相對均勻，當N/P比大于或等于40時，實現(xiàn)siRNA的完全包載。綜上所述，選擇SA-H8-PEG200050%/siRNA80:1和SA-H8-PEG2000/siRNA80:1作為最終處方。
　　由流式細胞分析的結果可知：在 A549與 MCF-7細胞中， SA-H8-

9、PEG200050%/siRNA和 SA-H8-PEG2000/siRNA的細胞攝取率都隨著時間的推移而增大，呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。SA-H8-PEG200050%/siRNA和 SA-H8-PEG2000/siRNA兩種載體形式的細胞攝取率明顯高于游離siRNA，但與市售制劑仍存在一定差距。
　　結論：
　　本研究所構建的載體可以有效包載 siRNA并顯著提高其細胞攝取水平。然而，為達到市售制劑的轉染能力，仍有必要對載體的