甲型流感PB1-F2分子特征及與人IFITM3基因關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、研究目的:
　　目前人流感的主要型別為甲型流感和乙型流感，其中甲型流感主要有季節(jié)性H3N2、甲型H1N1，人感染H7N9禽流感散在發(fā)生，相較于乙型流感，甲型流感具有罹患率高、重癥率高、死亡人數(shù)多等特點(diǎn)，抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換使病毒不斷免疫逃逸，從而人群中引起大范圍的傳播和流行。甲型流感病毒的PB1-F2蛋白是病毒重要的毒力因子，在病毒的感染致病過程中發(fā)揮重要作用。除病毒因素外，宿主個(gè)體遺傳性差異也是影響流感患者臨床結(jié)局的重要因素，IF

2、ITM3功能障礙往往預(yù)示患者的不良結(jié)局。本研究收集江寧醫(yī)院呼吸科甲型流感住院病例，分析了甲型流感病毒PB1-F2蛋白的遺傳變異特征和進(jìn)化趨勢(shì)，并分析了IFITM3基因rs12252位點(diǎn)各基因型在病例及對(duì)照中的分布，探討IFITM3基因多態(tài)性與流感易感性的關(guān)聯(lián)，欲從病毒與宿主遺傳易感性兩個(gè)方面探討甲型流感可能的致病作用。此外，本研究分析了甲型流感的細(xì)胞因子及血液生化指標(biāo)的改變及臨床意義，為甲流的后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:

3、
　　1.咽拭子進(jìn)行核酸提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、鑒定分型，甲型流感陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)，擴(kuò)增PB1基因序列。通過NCBI流感基因數(shù)據(jù)庫(kù)，下載2016-2017年全球甲型流感病毒的PB1毒株序列，運(yùn)用MEGA5.2軟件分析甲型流感PB1及PB1-F2蛋白的變異情況，采用Fasttree軟件繪制PB1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過在線軟件Datamonkey(http:/www.datamonkey.org)分析PB1序列的選擇性壓力。

4、
　　2.檢索Pubmed，Web of Science，Elsevier,中國(guó)知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫(kù)，查找有關(guān)IFITM3基因rs12252位點(diǎn)多態(tài)性與流感易感性關(guān)聯(lián)的病例對(duì)照或隊(duì)列研究。分別計(jì)算病例組與對(duì)照組暴露等位基因C相對(duì)于等位基因T的比值比(odds ratio，OR)及其95％CI。應(yīng)用Cochrane Q值檢驗(yàn)和I2值檢驗(yàn)各研究結(jié)果之間的一致性。
　　3.將核酸檢測(cè)流感陽性患者納入流感組，并分為重癥及輕癥，陰性納入流

5、感癥狀組，對(duì)照組數(shù)據(jù)來自千人基因組計(jì)劃漢族人群的結(jié)果。提取血液DNA，自行設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增rs12252位點(diǎn)序列，測(cè)序鑒定基因型。采用SPSS20.0及STATA.12軟件分析對(duì)照組HWE平衡，對(duì)基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建不同遺傳模型，比較各組IFITM3(rs12252)CC和CT/TT基因型分布，探討易感基因IFITM3(rs12252)與流感的關(guān)聯(lián)。
　　4.選擇甲型流感、流感癥狀及健康者的血清標(biāo)本，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組細(xì)胞因子白細(xì)

6、胞介素6(IL-6)、人白細(xì)胞介素10（IL-10）、人白細(xì)胞介素18(IL-18)、人白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、人γ干擾素（IFN-γ）、人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平;收集住院患者的血常規(guī)及生化36項(xiàng)的檢驗(yàn)結(jié)果，使用Epidata3.2軟件構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入細(xì)胞因子、血常規(guī)及生化檢驗(yàn)結(jié)果，SPSS20.0軟件分析比較各組血液生化水平差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.流感監(jiān)測(cè)結(jié)果:南京市2016年4月至2017年3月累

7、計(jì)報(bào)告ILI病例5621例，分離陽性毒株733例，分離陽性率為13.04％。季節(jié)性H3N2及乙型流感為主要流行株，主要流行于冬春季，5-25歲及25-60歲年齡組是流感的主要感染人群;江寧醫(yī)院采集流感樣病例咽拭子102例，19例流感陽性，陽性率18.63％,17例季節(jié)性H3N2亞型和2株乙型流感分離于冬春季，江寧地區(qū)流感流行及分布與南京地區(qū)整體分布相一致。
　　2.甲型流感PB1片段分子特征:2016-2017年全球各地區(qū)的季節(jié)性

8、H3N2亞型分離株P(guān)B1基因序列與疫苗株的同源性均較為相近，江寧地區(qū)分離株的核苷酸與氨基酸同源性分別為98.56％-98.88％，99.47％-99.74％。全球分離的甲型H1N1亞型流感病毒PB1的核苷酸、氨基酸與疫苗株A/Califomia/7/2009(H1N1)的同源性分別為97.95％-99.06％、98.93％-99.60％。全球及江寧地區(qū)H3N2分離株P(guān)B1片段均發(fā)生T152S及Y166F氨基酸位點(diǎn)變異，散在發(fā)生的氨基酸位

9、點(diǎn)變異有I181V、T257A、N328T、S375N和I667T。全球范圍的甲型H1N1亞型流感氨基酸位點(diǎn)均變異的有G154D、I397M、I435T，變異頻率較高的有P437L、Y467C。全球范圍H3N2流感IFEL模型篩選出正向選擇壓力位點(diǎn)428，江寧地區(qū)H3N2亞型流感經(jīng)FEL及REL模型篩選出正向選擇壓力位點(diǎn)539。H3N2流感PB1片的系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分為6個(gè)分支，江寧地區(qū)的分離株有13株位于分支Ⅲ，4株位于分支Ⅳ，甲型H1

10、N1亞型流感毒株主要進(jìn)化為兩大分支。
　　3.meta分析結(jié)果:共9篇文獻(xiàn)納入meta分析，合計(jì)流感病例1074例，其中重癥397例，輕癥677例，健康對(duì)照3510例。IFITM3基因rs12252位點(diǎn)等位基因C與流感感染存在顯著關(guān)聯(lián)，等位基因模型，顯性基因及隱性基因模型結(jié)果均顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(C vs T:OR=1.626，95％CI:1.395-1.895;CC+CT vs TT:OR=1.680,95％CI:1.362-2

11、.072;CC vs CT+TT:OR=2.155,95％CI:1.624-2.860)。亞組分析結(jié)果顯示，在高加索人群中，攜帶C等位基因是增加感染流感風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素，并且攜帶C等位基因與輕癥及重癥流感均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（重癥CvsT:OR=1.637，95％CI:1.039-2.579;輕癥C vs T:OR=1.373，95％CI:1.036-1.820），在亞洲人群中C等位基因與流感的重癥存在顯著關(guān)聯(lián)，與輕癥流感無關(guān)(重癥C vs

12、T:OR=2.272,95％CI:1.671-4.397;輕癥C vs T:OR=1.200,95％CI:0.928-1.553)。
　　4.IFITM3基因rs12252位點(diǎn)等位基因C與甲型流感的關(guān)聯(lián)性:C等位基因在東亞、非洲、美洲及歐洲人群中分布的頻率分別為52.78％、26.02％、17.72％和4.08％。本研究的甲型流感組、流感組、流感癥狀組及重癥流感組C等位基因頻率分別為52.94％、57.89％、54.22％和77.

13、78％。對(duì)照組的基因符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性;C等位基因模型、顯性基因模型及隱性基因模型的結(jié)果顯示，rs12252的C等位基因與甲型流感及流感的易感性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，而C等位基因與重癥流感顯著相關(guān)(OR=1.548，95％CI:1.187-2.019)。
　　5.甲型流感患者血清細(xì)胞因子水平改變:甲型流感病例組血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-18水平分別為(38.59±23.93)ng/

14、L、(7.75±4.37)ng/L、(22.27±14.78)ng/L及(74.70±43.80)ng/L，均顯著高于健康對(duì)照組;流感癥狀組血清TNF-α、IL-6及IFN-γ水平分別為(32.64±22.03)ng/L、(7.07±2.96)ng/L及(24.61±20.30)ng/L，均顯著高于健康對(duì)照組。
　　6.甲型流感病例血常規(guī)及生化指標(biāo)改變:甲型流感患者HBG、HCT、PLT、LYM及Baso水平分別為(127.84±

15、20.10)g/L、(39.54±4.75)、(185.94±47.22)×109/L、(1.60±0.70)×109/L及(0.01±0.01)×109/L均顯著低于對(duì)照組水平，CRP水平為(28.86±24.27)mg/L，高于對(duì)照組;流感癥狀組的HBG、LYM水平分別為(132.20±17.74)g/L和(1.74±0.72)×109/L，顯著低于對(duì)照組水平，CRP水平為(43.18±51.23)mg/L，高于對(duì)照組。甲型流感病例

16、組TP、ALB水平分別為(64.27±5.23)g/L、(37.56±4.99)g/L，低于對(duì)照組，GGT水平為(38.67±10.88)U/L，顯著升高。
　　研究結(jié)論:
　　1.甲型流感病毒PB1基因片段進(jìn)化較為保守，2016-2017年江寧分離的H3N2亞型流感毒株與全球其他地區(qū)的H3N2流感PB1片段進(jìn)化趨勢(shì)相一致，PB1-F2蛋白斷裂型流感毒株占據(jù)一定的比例，全球的甲型H1N1亞型流感毒株均表達(dá)長(zhǎng)度為11aa的PB

17、1-F2蛋白。未發(fā)現(xiàn)江寧地區(qū)分離株P(guān)B1-F2蛋白出現(xiàn)高致病性特征突變。其氨基酸位點(diǎn)變異的流行病學(xué)及臨床意義有待進(jìn)一步研究考證。
　　2.meta分析結(jié)果顯示IFITM3基因的SNP位點(diǎn)rs12252位點(diǎn)C等位基因與流感的易感性相關(guān)，在高加索人群中，C等位基因與輕癥及重癥流感均相關(guān)，而在亞洲人群中，C等位基因與重癥流感相關(guān)，與輕癥流感無統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)。
　　3.本研究納入病例經(jīng)等位基因模型、顯性模型及隱性模型的分析，未發(fā)現(xiàn)甲型流感