馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子在流感研究中的應(yīng)用及馬IFITM蛋白抗流感病毒的研究.pdf

1、流感病毒反向遺傳系統(tǒng)能夠在體外對(duì)流感病毒的基因組進(jìn)行操作，可以極大的方便對(duì)流感病毒的研究。流感病毒最小的復(fù)制單位由核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein complex，RNP）組成。在流感病毒反向系統(tǒng)中，PB1、PB2、PA、NP蛋白可以識(shí)別由I型RNA聚合酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)生成的負(fù)鏈病毒RNA，并以此為模板轉(zhuǎn)錄生成正鏈互補(bǔ)RNA及mRNA。真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子具有種屬特異性。一種生物的Ⅰ型RNA聚合酶不能識(shí)別另一種

2、生物的Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子。研究者已經(jīng)克隆了人源、犬源、雞源、鼠源Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子，并將其用于流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建。但是，目前為止，還沒(méi)有馬源Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子的研究報(bào)道。因此，對(duì)于流感病毒的很多研究不能在馬源細(xì)胞上進(jìn)行?；诖?，在本研究中，利用真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子的位置特點(diǎn)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中的馬基因組中，檢索并確定了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。以馬肺細(xì)胞基因組DNA為

3、模板，通過(guò)PCR，擴(kuò)增得到了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子，并構(gòu)建了不同長(zhǎng)度的馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的馬流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng)。結(jié)果表明馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子為500bp時(shí)，可以發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性。用建立的馬流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng)，對(duì)比了兩株馬流感病毒聚合酶活性的差異，發(fā)現(xiàn)PA蛋白可能是決定兩者聚合酶活性差異的關(guān)鍵蛋白。在本研究中，還使用該系統(tǒng)證實(shí)了馬MxA蛋白會(huì)影響流感病毒聚合酶活性。最后，利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子構(gòu)建了馬流感

4、病毒反向遺傳系統(tǒng)，成功拯救出一株野生型馬流感病毒和一株重組型馬流感病毒。馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子的成功克隆及應(yīng)用，豐富了我們對(duì)真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子的認(rèn)識(shí)。利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動(dòng)子構(gòu)建的流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng)是在馬源細(xì)胞上研究流感病毒聚合酶活性的有效工具，而在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的馬流感病毒反向系統(tǒng)將方便研究者在馬源細(xì)胞上對(duì)流感病毒進(jìn)行操作。
　　最近的研究表明，人源、豬源、雞源、鴨源、鼠源IFITM蛋白都具有抗流感病毒活性

5、。馬屬動(dòng)物是流感病毒的重要宿主，但對(duì)于馬源IFITM蛋白是否也具有抗流感病毒作用卻未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，通過(guò)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索馬IFITM基因，設(shè)計(jì)了靶向馬IFITM基因的特異性引物。通過(guò)RT-PCR，擴(kuò)增得到了6個(gè)馬IFITM基因。首先，我們描述了馬IFITM mRNA的表達(dá)特性：通過(guò)熒光定量PCR，檢測(cè)了馬源細(xì)胞及組織中的IFITM mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同IFITM的mRNA表達(dá)水平有所差異；經(jīng)干擾素處理和流感病毒感染

6、后，馬源細(xì)胞中IFITM mRNA表達(dá)水平會(huì)上調(diào)；但是感染馬皰疹病毒后，馬源細(xì)胞中IFITM mRNA表達(dá)水平未發(fā)生變化。然后，為了明確馬IFITM蛋白的細(xì)胞定位，構(gòu)建了表達(dá)馬IFITM蛋白的真核表達(dá)載體，間接免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)都表明馬IFITM蛋白成功表達(dá)；激光共聚焦實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明不同馬IFITM蛋白的細(xì)胞定位并不相同；其中，馬IFITM3蛋白與LAMP1蛋白呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象，而其它馬IFITM蛋白不與LAMP1蛋白

7、共定位。最后，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源表達(dá)質(zhì)粒和構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IFITM蛋白細(xì)胞系這兩種策略，利于基于I型RNA聚合酶啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)了馬IFITM蛋白的抗流感活性：通過(guò)慢病毒感染實(shí)驗(yàn)，建立了穩(wěn)定表達(dá)馬IFITM蛋白的MDCK細(xì)胞系；間接免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果表明，在MDCK細(xì)胞系中，馬IFITM蛋白都成功表達(dá)；利用基于馬或犬I型RNA聚合酶啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，證實(shí)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或者穩(wěn)定表達(dá)馬IFITM蛋白都會(huì)限制流感病毒復(fù)制

8、。對(duì)馬源 IFITM蛋白的抗流感病毒活性研究，將加深我們對(duì)IFITM蛋白抗流感病毒作用的理解，也為相應(yīng)的抗流感藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
　　2012年以來(lái)，在馬群中發(fā)現(xiàn)了三種新的黃病毒科病毒：馬丙型肝炎病毒（equine hepatitis C virus，EHCV）、EPgV（equine pegivirus）、泰勒病相關(guān)病毒（Theiler’s disease-associated virus，TDAV）。目前，在世界范圍內(nèi)

9、，關(guān)于這三種新發(fā)馬病病毒的報(bào)道較少。在國(guó)內(nèi)的馬群中，也沒(méi)有這三種病毒的流行病學(xué)報(bào)道。在2014年和2015年，我們從國(guó)內(nèi)的馬群中采集了177份血清樣品。通過(guò)PCR，在血清樣品中，檢測(cè)到了6份EHCV陽(yáng)性樣品和2份EPgV陽(yáng)性樣品。在檢測(cè)過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩種病毒共感染的證據(jù)。在所有樣品中沒(méi)有檢測(cè)到TDAV核酸。對(duì)EHCV的NS5B基因、NS3基因、5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列以及EPgV的NS3基因序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果表明，EHCV和EPgV已