POU4F1在黑素瘤中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　黑素瘤是一種起源于黑素細胞的皮膚惡性腫瘤，具有惡性程度高、死亡率高等特點。近年來，黑素瘤在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈快速增長趨勢，已經(jīng)是歐美地區(qū)發(fā)病率增長速度最快的惡性腫瘤之一。我國屬黑素瘤發(fā)病率較低地區(qū)，但由于我國人口基數(shù)大黑素瘤患者人數(shù)眾多，并且我國黑素瘤發(fā)病率也處于持續(xù)增長狀態(tài)，因此對黑素瘤進行深入的分子機制研究對提高黑素瘤的診療效果、提高國民健康水平具有重要意義。
　　根據(jù)以往研究，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分

2、子參與了黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。BRAF和NRAS是MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白激酶，在超過50％的黑素瘤病例中存在活化性基因突變，突變的BRAF和NRAS基因使MAPK通路過度激活促進黑素瘤細胞的增殖。PI3K通路中的抑制分子PTEN在黑素瘤中存在較高頻率的失活突變，突變的PTEN喪失對PI3K通路的抑制活性，從而促進黑素瘤細胞增殖。此外，較多研究證實起源于外胚層神經(jīng)嵴細胞的黑素細胞在其惡性轉(zhuǎn)化過程中神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達量增加。M

3、ITF是胚胎發(fā)育過程中促進神經(jīng)嵴細胞分化為黑素細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，在部分黑素瘤患者腫瘤組織中高表達并發(fā)揮促進細胞增殖的作用；神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的SOX家族多種轉(zhuǎn)錄因子，如SOX2、SOX4、SOX9等均參與到黑素瘤細胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，主要表達于胚胎早期神經(jīng)細胞內(nèi)的POU家族轉(zhuǎn)錄因子，如POU5F1、POU3F2等，在黑素瘤組織及細胞系中高表達并發(fā)揮促腫瘤作用。
　　POU4F1是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要分

4、子，在胚胎發(fā)育的早期表達于中樞神經(jīng)前體細胞。轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可與Bcl-2基因啟動子區(qū)結(jié)合調(diào)控Bcl-2基因的表達，并可與 P53蛋白發(fā)生蛋白質(zhì)間相互作用調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。通過以上作用，轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可發(fā)揮促進神經(jīng)系統(tǒng)分化和抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)POU4F1具有促進細胞增殖的作用，黑素瘤中POU4F1可保護細胞基因組DNA并降低DNA損傷程度，逆轉(zhuǎn)由于BRAF突變導(dǎo)致的細胞衰老現(xiàn)象，從而促進黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。但

5、是目前尚缺少黑素瘤中轉(zhuǎn)錄因子POU4F1作用的全面研究，且POU4F1在黑素瘤細胞中的作用機制尚不清楚。因此，本課題旨在全面地檢測轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，并對其作用機制做進一步的研究。
　　研究方法：
　　1.使用Real-time PCR對原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系，以及色素痣組織和黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平表達量的檢測。
　　2.通過Western blot檢測PO

6、U4F1在原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系以及色素痣組織和黑素瘤組織中的蛋白表達水平。
　　3.使用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將POU4F1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hs294T和A2058細胞內(nèi)，使細胞過表達POU4F1
　　4. CCK8試劑對不同生長時間點的細胞染色，比較POU4F1過表達組與對照組細胞生長數(shù)量的差異。
　　5. AnexinⅤ-FITC和PI染色體系對POU4F1過表達組與對照組細胞進行標記，流式細胞術(shù)檢測

7、各組細胞中凋亡細胞的數(shù)量。
　　6. Western blot技術(shù)檢測過表達POU4F1細胞內(nèi)磷酸化ERK的含量。
　　7.使用克隆形成實驗技術(shù)，對POU4F1過表達組與對照組細胞生長兩周后細胞克隆數(shù)進行比較，并分析兩組在ERK劑作用下細胞克隆形成數(shù)量的差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細胞系和組織中的表達
　　各細胞系及組織中均存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達，且mRNA水平與

8、蛋白水平表達水平一致。細胞系中實驗結(jié)果顯示：中原代黑素細胞和黑素細胞系中 POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達量較低，而黑素瘤細胞系中 POU4F1表達量較高；組織中實驗結(jié)果顯示：黑素瘤組織中POU4F1蛋白表達量顯著高于色素痣組織（n=8，P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤細胞中的作用
　　POU4F1低表達的黑素瘤細胞可外源地提高POU4F1的表達（約2.3倍，P<0.05）。過表達POU4F1的黑素瘤細胞相較

9、于對照組，細胞在轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后第72小時和第96小時，細胞數(shù)量均明顯增高（P<0.001）。凋亡水平檢測結(jié)果顯示：在 H2O2刺激下，過表達POU4F1組細胞凋亡水平顯著低于對照組細胞（過表達組33.8%±1.25%，對照組20.2%±0.83%，P<0.01）。細胞遷移實驗結(jié)果示：過表達POU4F1對黑素瘤細胞的遷移能力無顯著影響（過表達組135.7±6.8，對照組124±9.8，P>0.05）。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1

10、促黑素瘤細胞增殖機制的初步探討
　　過表達POU4F1的黑素瘤細胞內(nèi)，ERK的磷酸化水平顯著增高（約3.5倍，P<0.01）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示：過表達 POU4F1組細胞克隆形成數(shù)顯著高于對照組（過表達組為542±3.4，對照組為304±3.9，P<0.001）；過表達POU4F1的細胞給予ERK抑制劑處理后，細胞克隆數(shù)顯著降低（過表達組為542±3.4，過表達+抑制劑組為126±2.6， P<0.001）。ERK上游激酶MA

11、P2K2基因啟動子區(qū)存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并且POU4F1過表達細胞內(nèi)MAP2K2的mRNA和蛋白水平均升高。
　　研究結(jié)論：
　　通過以上研究，我們證實 POU4F1在黑素瘤中表達量高于原代黑素細胞及色素痣組織，并首次在黑素瘤細胞中明確了 POU4F1具有促進細胞增殖并抑制細胞凋亡的作用。針對POU4F1的促腫瘤增殖作用，我們進一步探討了POU4F1對ERK活性的激活作用，提示 POU4F1通過激活 ERK活性