SIP1在增生性瘢痕形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　增生性瘢痕的形成是由于各種原因?qū)е碌娜苏嫫ど顚咏M織損傷致使局部成纖維細(xì)胞增殖,膠原合成增加所造成的一種纖維化疾病。大量研究表明,有眾多細(xì)胞因子參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的作用最為重要,在瘢痕形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β1的生物學(xué)活性主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Smads家族成員介導(dǎo)。Smads蛋白在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)與多種轉(zhuǎn)錄因子交互作用后

2、調(diào)控基因表達(dá)。SIP1(Smad interacting protein1,SIP1)可以和Smads蛋白結(jié)合,拮抗TGF-β1通路;SIP1還通過(guò)結(jié)合基因上游特定區(qū)域的方式抑制膠原基因的轉(zhuǎn)錄。近期Kato M等研究表明,在腎纖維化組織中發(fā)現(xiàn)SIP1低表達(dá),表明TGF-β1介導(dǎo)的腎纖維化與包括SIP1在內(nèi)的ZEB家族蛋白的缺乏相關(guān)。本課題組前期在mRNA水平觀察到:相比較正常皮膚組織,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達(dá),提示了SIP1表達(dá)

3、的不足與其纖維化發(fā)生相關(guān)。但SIP1在增生性瘢痕形成中的具體作用尚不明確,因此本課題將進(jìn)一步對(duì)SIP1在增生性瘢痕發(fā)病中的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,為臨床增生性瘢痕的預(yù)防和治療提供新的理論支持。
　　【研究目的】
　　1.明確SIP1在增生性瘢痕組織和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.明確SIP1在增生性瘢痕形成中的作用;體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用兔耳瘢痕模型進(jìn)行驗(yàn)證。
　　【研究?jī)?nèi)容】

4、
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)和組織免疫熒光的方法檢測(cè)增生性瘢痕組織中 SIP1的表達(dá)情況;應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中 SIP1的表達(dá)情況;應(yīng)用Western-blot檢測(cè)SIP1、α-SMA和COLⅠA2在增生性瘢痕組織中的表達(dá)。
　　2.用TGF-β1作用正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)SIP1、α-SMA和COLⅠA2的表達(dá)影響。
　　3.通過(guò)構(gòu)建SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒,并轉(zhuǎn)染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后檢

5、測(cè)SIP1和相關(guān)纖維化因子α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ,及磷酸化 Smad2(P-Smad2)和磷酸化Smad3(P-Smad3)的表達(dá)情況;構(gòu)建兔耳瘢痕模型,觀察SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒對(duì)瘢痕膠原纖維的作用。
　　【研究結(jié)果】
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達(dá)。
　　2.組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達(dá)。

6、
　　3.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,與自體正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞相比較,SIP1在增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞中低表達(dá)。
　　4.Western-blot結(jié)果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達(dá),而瘢痕纖維化指標(biāo)α-SMA和COLⅠA2表達(dá)則升高。
　　5.正常成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用后,Western-blot結(jié)果顯示,SIP1的表達(dá)逐漸降低;而α-SMA和COLⅠA2的表達(dá)則逐漸升高

7、。
　　6.Western-blot結(jié)果顯示,在SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細(xì)胞后,α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào);當(dāng)細(xì)胞給予 TGF-β1刺激后,各組α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ的表達(dá)均上調(diào),但SIP1過(guò)表達(dá)+ TGF-β1組蛋白表達(dá)水平仍低于對(duì)照+TGF-β1組。
　　7.Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,在 SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細(xì)胞后,P-Smad2和P-Smad

8、3的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào);當(dāng)細(xì)胞給予TGF-β1刺激后,各組P-Smad2和P-Smad3的表達(dá)均上調(diào),但SIP1過(guò)表達(dá)+TGF-β1組蛋白表達(dá)水平仍低于對(duì)照+TGF-β1組。
　　8.為了驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型,SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒注射兔耳增生性瘢痕后,經(jīng)Masson染色后觀察到,正常兔耳皮膚的膠原淺薄疏松,排列規(guī)整;在對(duì)照組、PBS處理組和陰性病毒對(duì)照組的真皮層較厚,膠原纖維粗大致密,排列方向紊亂;而在

9、 SIP1過(guò)表達(dá)腺病毒處理組的兔耳皮下膠原纖維密度下降,排列方向較規(guī)整。
　　【研究結(jié)論】
　　1.與自體正常皮膚組織及其來(lái)源的成纖維細(xì)胞比較,在增生性瘢痕組織及其衍生的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中SIP1表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　2.TGF-β1可誘導(dǎo)正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA和COLⅠA2,同時(shí)抑制SIP1的表達(dá)。
　　3.利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在瘢痕成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá) SIP1后可顯著抑制纖維化相關(guān)因子α-S