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文檔簡介
1、【研究背景和目的】轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因,但是對胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍知之有限。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制一直是胃癌研究中的熱點,它涉及多個基因、多條信號通路的交互作用。研究發(fā)現(xiàn)那些調(diào)控、連接胃癌轉(zhuǎn)移的多條信號通路的關(guān)節(jié)點,對于理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制,開發(fā)胃癌轉(zhuǎn)移治療的靶向藥物具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子可參與多種信號通路的調(diào)控。研究表明轉(zhuǎn)錄因子既可以作為癌基因又可以作為抑癌基因發(fā)揮作用,然而它們在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用至今仍不清楚。我們發(fā)現(xiàn)了一個在其
2、他類型腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子POU2F2,在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。我們發(fā)現(xiàn) POU2F2在有轉(zhuǎn)移的胃癌中呈高表達,但其在胃癌中異常表達的原因、意義、功能和調(diào)控機制都不清楚。
【方法】
1.用 WB的方法檢測 POU2F2在正常胃上皮細胞及不同轉(zhuǎn)移能力的胃癌細胞系中的表達。進一步用免疫組化的方法檢測并分析了有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的胃癌及配對癌旁組織中POU2F2的表達,并分析POU2F2的表達與胃癌預(yù)后的關(guān)
3、系。
2.通過調(diào)控 POU2F2表達,在體外及體內(nèi)分別驗證 POU2F2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。采用生物信息學方法預(yù)測POU2F2下游可能的結(jié)合位點,并通過CHIP-Seq, EMSA以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。并在功能學水平進一步驗證其對胃癌轉(zhuǎn)移的影響。
3.通過文獻回顧,篩選POU2F2上游潛在作用的靶基因。再次通過生物信息學方法預(yù)測該靶基因與POU2F2啟動子區(qū)的可能結(jié)合位點。通過CHIP-Seq,EM
4、SA以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C其相互作用。并且通過調(diào)控 POU2F2和 ROBO1的表達,分別在體外及體內(nèi)檢測該信號通路對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
4.使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-218對NF-κB/POU2F2/SLIT2/ROBO1信號通路多個位點的調(diào)控,進而在功能學上檢測其對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
【結(jié)果】
1.POU2F2蛋白在正常胃粘膜細胞系GES-1中幾乎不表達。與GES-1細胞相比,雖
5、然低轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細胞(MKN28-NM,SGC7901-NM)中的POU2F2蛋白升高了2倍,但在高轉(zhuǎn)移胃癌細胞系SGC7901-M,MKN28-M中POU2F2的表達升高了約9倍。癌旁組織中POU2F2表達的陽性率為4.00%;胃癌組織中,POU2F2表達的陽性率為65.52%,然而僅有6.00%無淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中POU2F2表達陽性,而84.97%轉(zhuǎn)移性胃癌組織POU2F2表達陽性。POU2F2在胃癌中表達高于癌旁組織
6、者其腫瘤淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移率高,TNM分期較晚,患者生存期更短。
2.轉(zhuǎn)染POU2F2 shRNA的SGC7901-M細胞體外遷移、侵襲能力分別下降。裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實驗中,感染POU2F2 shRNA的SGC7901-M細胞在裸鼠的肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。同時轉(zhuǎn)染 POU2F2慢病毒表達載體可恢復細胞的高轉(zhuǎn)移能力。生物信息學預(yù)測ROBO1為POU2F2可能的下游結(jié)合位點。CHIP-Seq,EMSA以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步
7、證實 POU2F2與 ROBO1基因的啟動子區(qū)相結(jié)合。體內(nèi)及體外功能學實驗分別顯示POU2F2通過ROBO1促進胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
3.文獻回顧提示POU2F2可能是NF-κB的下游靶基因。通過生物信息學預(yù)測,并結(jié)合CHIP-Seq,EMSA以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了NF-κB與POU2F2基因啟動子區(qū)的結(jié)合。激活NF-κB可增加POU2F2和ROBO1的表達并在體內(nèi)外均促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。抑制 NF-κB的活性可看到相反
8、的表型。在 NF-κB激活的條件下,下調(diào) POU2F2的表達可降低 ROBO1的表達水平并使胃癌細胞體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移能力隨之減低。用shPOU2F2敲除POU2F2后,再過表達ROBO1可使胃癌細胞恢復體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移能力。
4.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱩iR-218可直接結(jié)合并同時調(diào)控POU2F2, IκK-β和ROBO1。體內(nèi)外功能學實驗顯示上調(diào)miR-218可抑制POU2F2, IκK-β和ROBO1的表達,并抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)
9、移能力;相反,下調(diào) miR-218可引起 POU2F2, IκK-β和ROBO1的表達增高,促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。于此同時,抑制POU2F2, IκK-β和ROBO1其中任一個的表達可看到類似miR-218過表達的表型;然而通過轉(zhuǎn)染不含有miR-218結(jié)合位點的載體來過表達IKK-β, POU2F2和 ROBO1,可部分逆轉(zhuǎn)因過表達miR-218而產(chǎn)生的抑制胃癌轉(zhuǎn)移的表型。
【結(jié)論】
1.POU2F2通過正性調(diào)控ROB
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