microRNA-133b調(diào)控在脊髓損傷再生修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷是一種常見(jiàn)的脊柱外科傷病，多見(jiàn)于高處墜落、交通意外、運(yùn)動(dòng)傷害及暴力傷害，近年來(lái)發(fā)病率逐漸增高。脊髓損傷可造成嚴(yán)重的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)的功能障礙，且預(yù)后較差。尤其是頸段脊髓損傷，不僅最為常見(jiàn)、傷情最為嚴(yán)重，且累及上肢及手的功能，嚴(yán)重?fù)p害了患者的自理能力和生活質(zhì)量。探明脊髓損傷的內(nèi)在病理機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上尋求改善脊髓損傷患者運(yùn)動(dòng)功能預(yù)后的方法，是該領(lǐng)域研究中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　microRNA是一種通過(guò)調(diào)控靶mRN

2、A，而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)功能的單鏈非編碼RNA。近年的研究提示了脊髓損傷后出現(xiàn)了miRNA失調(diào)。而這些失調(diào)的miRNA從不同的途徑參與到了脊髓損傷后炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和軸突再生抑制的過(guò)程中。其中有研究提示miRNA-133b對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但目前對(duì)于其在哺乳動(dòng)物脊髓損傷病理過(guò)程及再生修復(fù)中作用的體內(nèi)研究尚無(wú)報(bào)道。
　　第一部分 頸脊髓鈍挫傷小鼠行為學(xué)分析與miR-133b表達(dá)分析
　　目的：
　　建立一個(gè)

3、穩(wěn)定的小鼠頸脊髓鈍挫傷模型，分析其運(yùn)動(dòng)功能變化趨勢(shì)，并明確脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)miR-133b表達(dá)變化。
　　方法：
　　訓(xùn)練小鼠抓握能力，以完成損傷后的握力測(cè)量。實(shí)驗(yàn)小鼠分為。損傷組:行頸5脊髓鈍挫傷造模，使用Infinite Horizon脊髓打擊儀以80Kdyn劑量急性脊髓打擊。;假手術(shù)組:行單純椎板切除術(shù)。在損傷前及損傷后各時(shí)間點(diǎn)點(diǎn)進(jìn)行前肢握力測(cè)量、前肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。在損傷后使用qRT-PCR方法檢測(cè)各組小鼠脊髓損傷

4、區(qū)成熟miR-133b表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　假手術(shù)組小鼠在術(shù)后早期因手術(shù)傷口疼痛，出現(xiàn)握力測(cè)量值的暫時(shí)下降。自手術(shù)后1周，傷口逐漸恢復(fù)，握力值亦逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平。手術(shù)后，損傷組小鼠在最初1周內(nèi)，四肢運(yùn)動(dòng)功能?chē)?yán)重?fù)p傷，無(wú)法使用前爪進(jìn)行任何動(dòng)作;自7d-14d進(jìn)行握力測(cè)量時(shí)，小鼠嘗試抓握測(cè)量桿，但無(wú)法完成成功的抓握，或及時(shí)能夠完成抓握，但無(wú)法抵抗?fàn)坷?，完成測(cè)量。自21d-56d可配合完成測(cè)量，前爪握力隨時(shí)間逐漸出現(xiàn)輕微改

5、善，但明顯低于術(shù)前水平，表明存在嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，損傷組小鼠握力值均顯著低于假手術(shù)組小鼠握力值(P＜0.05)。
　　假手術(shù)組小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脊髓成熟miR-133b的表達(dá)維持在穩(wěn)定水平，各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。以假手術(shù)組小鼠脊髓成熟miR-133b表達(dá)作為對(duì)照組，損傷組小鼠自損傷后第1天成熟miR-133b表達(dá)略上升，但與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);損傷后第3天，損傷組小鼠脊

6、髓成熟miR-133b表達(dá)開(kāi)始下降，損傷后第7天，成熟miR-133b表達(dá)降至最低值，損傷后第14天，略微回升，但仍低于對(duì)照組(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　握力測(cè)量是評(píng)估脊髓損傷小鼠的前肢運(yùn)動(dòng)功能敏感、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。而脊髓損傷后miR-133b會(huì)隨時(shí)間出現(xiàn)顯著的下調(diào)。
　　第二部分 miR-133b對(duì)下游靶基因表達(dá)的影響
　　目的：
　　探尋脊髓損傷病理過(guò)程中miR-133b的關(guān)鍵下游靶mRNA，并

7、探討miR-133b對(duì)這些靶mRNA的調(diào)控作用。
　　方法：
　　分別使用外源性miR-133bmimic、miR-133b抑制劑、miR-陰性對(duì)照對(duì)小鼠脊髓損傷區(qū)顯微注射進(jìn)行過(guò)表達(dá)、低表達(dá)和陰性對(duì)照。在損傷后各時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本，使用qRT-PCR檢測(cè)小鼠脊髓損傷區(qū)成熟miR-133b表達(dá)變化。使用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)篩選miR-133b與神經(jīng)生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的靶mRNA，使用qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)各組小鼠

8、相關(guān)靶基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　脊髓損傷發(fā)生后，各組小鼠損傷區(qū)成熟miR-133b表達(dá)水平均隨時(shí)間發(fā)生了顯著的變化。與相同時(shí)間點(diǎn)單純損傷組相比，陰性對(duì)照組小鼠成熟miR-133b均無(wú)顯著變化;miR-133b組小鼠各時(shí)間點(diǎn)成熟miR-133b表達(dá)較手術(shù)組和陰性對(duì)照組顯著升高(p＜0.05)，其中在術(shù)后第3天達(dá)到最高值;抑制劑組小鼠各時(shí)間點(diǎn)成熟miR-133b表達(dá)則低于手術(shù)組和陰性對(duì)照(p＜0.05)。
　　生物

9、信息數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的關(guān)鍵下游靶基因包括RhoA、Stathmin4，而Stathmin1作為Stathmin4的同家族成員，具有高度相似的編碼和結(jié)構(gòu)，亦納入研究。qRT-PCR和Western blot的結(jié)果提示單純損傷組小鼠脊髓損傷區(qū)RhoA蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間出現(xiàn)上調(diào)、Stathmin1蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間出現(xiàn)下調(diào);與同時(shí)間點(diǎn)單純損傷組小鼠相比，miR-133b組小鼠RhoA蛋白表達(dá)水平下調(diào)、Stathmin1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。
　

10、　結(jié)論：
　　外源性miR-133b mimic可通過(guò)局部注射方法被受損組織有效攝取并進(jìn)入代謝環(huán)節(jié)生成成熟miR-133b，同時(shí)誘導(dǎo)了RhoA和Stathmin1這兩種重要的神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)改變。提示脊髓損傷后miR-133b表達(dá)水平的變化可能通過(guò)調(diào)控RhoA/ROCK途徑和Stathmin1，參與脊髓神經(jīng)軸突再生修復(fù)過(guò)程。
　　第三部分 miR-133b對(duì)小鼠脊髓損傷修復(fù)再生的影響
　　目的：
　　探討m

11、iR-133b對(duì)損傷小鼠皮質(zhì)脊髓束軸突再生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的影響，評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)功能變化。
　　方法：
　　分別使用miR-133b mimic、miR-陰性對(duì)照和miR-133b抑制劑對(duì)脊髓損傷后小鼠損傷局部進(jìn)行注射。通過(guò)握力測(cè)量評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況;通過(guò)皮質(zhì)脊髓束B(niǎo)DA示蹤和軸突計(jì)數(shù)評(píng)估損傷后軸突再生情況;通過(guò)Western blot檢測(cè)凋亡caspase3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，評(píng)估細(xì)胞凋亡情況;通過(guò)免疫熒光GFAP

12、與DAPI共染色評(píng)估細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)趨勢(shì)和細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　miR-133b治療組小鼠在損傷后第7天起部分小鼠前爪功能便出現(xiàn)了初步的恢復(fù)，握力隨時(shí)間逐步改善。損傷后28d-56d治療組小鼠握力較同期單純損傷組改善。抑制劑組小鼠損傷后的前肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較慢，在損傷后14天，該組小鼠仍無(wú)法完成成功的抓握測(cè)試。直到損傷后21天，小鼠握力才出現(xiàn)逐步改善。但各時(shí)間點(diǎn)該組小鼠左右前爪單獨(dú)握力及雙爪同時(shí)握力均明顯低于同期單純損

13、傷組小鼠(P＜0.05)。
　　對(duì)比各組損傷區(qū)下段各切層軸突的相對(duì)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，單純損傷組小鼠與miR陰性對(duì)照組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯(p＞0.05)。而miR-133b組小鼠損傷區(qū)下段各切層軸突的相對(duì)計(jì)數(shù)均高于單純損傷組(P＜0.05)。
　　通過(guò)比較各組小鼠損傷區(qū)凋亡蛋白Caspase3表達(dá)量，評(píng)估細(xì)胞凋亡程度。結(jié)果顯示在損傷后3天、7天，miR-133b治療組小鼠損傷區(qū)Caspase3蛋白表達(dá)均低于同時(shí)期單純損傷組小鼠。

14、>　　與單純脊髓損傷組相比，在miR-133b治療組小鼠脊髓損傷區(qū)切片中可見(jiàn)GFAP標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞分布更加規(guī)律，且有向損傷區(qū)外長(zhǎng)入的趨勢(shì);miR-133b組小鼠DAPI標(biāo)記的凋亡細(xì)胞顯著低于脊髓損傷組。
　　結(jié)論：
　　過(guò)表達(dá)miR-133b可使小鼠脊髓損傷區(qū)的軸突向損傷區(qū)外周長(zhǎng)入，并減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，最終使脊髓損傷小鼠獲得運(yùn)動(dòng)功能的部分改善;而抑制miR-133b則明顯減緩了小鼠脊髓損傷后自主修復(fù)過(guò)程。提示了miR-13