抑制IKK-NF-κB信號(hào)通路在脊髓損傷中的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 脊髓損傷嚴(yán)重威脅人類健康，目前尚無有效的治療手段。脊髓損傷分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。早期干預(yù)繼發(fā)性損傷，可以改善脊髓組織的生存狀況，為功能恢復(fù)保存必需的解剖結(jié)構(gòu)，這代表了脊髓損傷治療的一種潛在方向。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的主要成分，在急性脊髓損傷的病理生理學(xué)機(jī)制中處于中心地位。炎癥反應(yīng)主要受基因表達(dá)調(diào)控。核因子kappaB(thenuclearfactor-kappaB，NF-κB)家族是炎癥相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

2、，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。脊髓損傷后，異常激活的NF-κB可以啟動(dòng)神經(jīng)元的凋亡，抑制NF-κB可以減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善功能恢復(fù)。IKKs是激活NF-κB的主要蛋白激酶，在調(diào)節(jié)NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄中處于中心地位。IKKβ亞基是IKKs的主要催化亞基，不但能磷酸化I-κB，導(dǎo)致其泛素化及被26S蛋白酶體降解，從而激活NF-κB，而且可直接磷酸化NF-κB亞單位p65的Ser563位

3、點(diǎn)，引起NF-κB激活，因此成為調(diào)節(jié)NF-κB活性的主要上游靶點(diǎn)。BMS-345541是IKKβ的選擇性抑制劑，可在小鼠腦中風(fēng)模型中，抑制IKKβ活性，減少炎癥基因表達(dá)和神經(jīng)元凋亡，但是其在脊髓損傷中的作用尚不明確。本研究擬探討B(tài)MS-345541對(duì)脊髓損傷后IKK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，了解BMS-345541對(duì)脊髓損傷后IKKβ激酶活性、NF-κB的激活、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及誘導(dǎo)浸潤(rùn)的粘附分子的表達(dá)、脊髓組織細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白

4、的表達(dá)，以及神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、健康成年雌性SD大鼠，應(yīng)用改良Allen法建立大鼠中度脊髓損傷模型，損傷位置在胸12椎體，損傷能量為25g*cm。
　　 2、將實(shí)驗(yàn)大鼠分成3組，分別為假手術(shù)組（僅切除椎板，不損傷脊髓），脊髓損傷組（損傷脊髓，給予1％的DMSO，50μl/公斤體重）和BMS-345541治療組(損傷脊髓，給予BMS-3455410.5mg/公斤體重）。

5、
　　 3、給藥方式:在損傷脊髓下方0.5cm處硬膜下穿刺，將藥物或溶劑注射進(jìn)入硬膜下腔腦脊液中。
　　 4、觀測(cè)BMS-345541對(duì)IKKβ亞基激酶活性的影響:在脊髓損傷前10分鐘硬膜下注入相應(yīng)藥物，在脊髓損傷后0.5hr、4hr、12hr、24hr和72hr處死動(dòng)物取1cm脊髓組織，應(yīng)用IKKβ激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)激酶活性。在傷后12hr處死動(dòng)物取1cm脊髓組織標(biāo)本，免疫印跡分析檢測(cè)磷酸化Ⅰ-κBα蛋白

6、表達(dá)。
　　 5、觀測(cè)BMS-345541對(duì)大鼠急性脊髓損傷后NF-κB激活及運(yùn)動(dòng)功能的影響。在脊髓損傷后15分鐘硬膜下注入相應(yīng)藥物，在脊髓損傷后24hr處死動(dòng)物取1cm脊髓組織，應(yīng)用免疫印跡分析和免疫組織化學(xué)檢測(cè)脊髓損傷后NF-κBp65的表達(dá)，應(yīng)用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)脊髓損傷后1－14天后肢運(yùn)動(dòng)功能。
　　 6、觀測(cè)BMS-345541對(duì)大鼠急性脊髓損傷后細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。在脊髓損傷后15分鐘硬膜下注入相應(yīng)藥物

7、，在脊髓損傷后24小時(shí)處死動(dòng)物取1cm長(zhǎng)脊髓標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡分析檢測(cè)脊髓損傷后組織中Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)。應(yīng)用免疫印跡分析脊髓損傷后組織中ICAM-1蛋白表達(dá)。應(yīng)用MPO活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脊髓標(biāo)本中MPO活性。應(yīng)用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脊髓損傷后組織中細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、脊髓損傷后IKKβ激酶活性傷后30分鐘開始升高，4小時(shí)明顯升高，為1.05

8、±0.043單位/毫克，12小時(shí)達(dá)到高峰，為1.47±0.037，24小時(shí)下降到0.71±0.027，72小時(shí)后恢復(fù)到正常水平。BMS－345541干預(yù)可以明顯抑制IKKβ激酶活性。與脊髓損傷組相比較，在傷后4小時(shí)和12小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，干預(yù)組中IKKβ激酶活性下降近50％，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。脊髓損傷后，磷酸化I-κBα蛋白明顯增高(P＜0.01);BMS一345541干預(yù)可以明顯抑制磷酸化I-κBα蛋白表達(dá)的增高(P＜0

9、.05)。
　　 2、在脊髓損傷后24小時(shí)，假手術(shù)大鼠脊髓組織中幾乎沒有NF-κBp65陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞的比例為1.02±0.32％;脊髓損傷組中大鼠的脊髓組織中NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，陽性細(xì)胞的比例達(dá)到34.65±1.73％，與假手術(shù)組中的大鼠相比較有顯著性差異(p＜0.05);BMS-345541治療可以明顯減少脊髓組織中NF-κBp65陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞比例為10.87±0.56％。蛋白免疫印跡方法結(jié)果

10、進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)論。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯示:在脊髓損傷后第一天，脊髓損傷組中大鼠和BMS-345541治療組均表現(xiàn)出嚴(yán)重的后肢功能障礙，平均評(píng)分分別是1.2±0.25和1.1±0.14，與假手術(shù)組中大鼠比較有顯著性差異(p＜0.01)，然而它們兩者之間無顯著性差異(p=0.46)。在脊髓損傷后14天，脊髓損傷組中的大鼠后肢僅僅恢復(fù)了三關(guān)節(jié)（髖、膝、踝）的運(yùn)動(dòng)，平均分為6.8±0.4;而BMS-345541治療組中大鼠的后肢能能

11、夠足底負(fù)重步行，平均得分為10.4±0.5。與脊髓損傷組中的大鼠相比較，BMS-345541治療組中的大鼠在脊髓損傷后14天的平均得分提高了近50％。
　　 3、在脊髓損傷后24小時(shí)，損傷組中MPO活性和ICAM-1的表達(dá)明顯升高，BMS-345541治療可以明顯抑制它們的升高;脊髓損傷后凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，BMS-345541治療可以明顯減少脊髓組織中細(xì)胞的凋亡。免疫組化和Westernblot方法均顯示:與假手術(shù)組中的大

12、鼠相比較，脊髓損傷后大鼠脊髓中激活型caspase-3表達(dá)明顯增加，BMS-345541治療可以明顯減少脊髓組織中激活型caspase-3的表達(dá);脊髓損傷后Bax表達(dá)明顯增加，BMS-345541治療可以明顯減少脊髓組織中Bax的表達(dá);在術(shù)后24小時(shí)，假手術(shù)組中幾乎沒有Bcl－2表達(dá)，脊髓損傷組和BMS-345541治療組可見脊髓組織中Bcl－2表達(dá)明顯增加，BMS—345541對(duì)Bcl—2的表達(dá)無影響。
　　 結(jié)論:
　

13、　 1、脊髓損傷后IKKβ激酶活性明顯升高，4小時(shí)明顯升高，12小時(shí)達(dá)到高峰，抑制IKKβ激酶活性的藥物作用時(shí)間窗口應(yīng)該在傷后4小時(shí)內(nèi);BMS－345541可抑制脊髓損傷后的IKKβ激酶活性，從而為其在脊髓損傷的治療提供了理論依據(jù)。
　　 2、急性脊髓損傷后硬膜下注射BMS－3455414可以有效抑制脊髓損傷導(dǎo)致的NF-κB的激活;BMS－345541可改善急性脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，表明其對(duì)脊髓損傷具有治療意義。