T淋巴細胞在脊髓損傷修復中的作用研究.pdf

1、免疫炎癥反應是脊髓繼發(fā)損傷的重要因素，包括固有免疫反應和適應性免疫反應。固有免疫反應通過抗原提呈作用和細胞因子的釋放激活適應性免疫，同時也是適應性免疫的效應系統(tǒng)，二者之間相互聯(lián)系，相互作用共同維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，適應性免疫的T淋巴細胞對固有免疫反應的調(diào)節(jié)有重要意義，能通過抑制炎癥因子的釋放，防止固有免疫過度活化而造成組織損傷。脊髓損傷后的免疫炎癥反應過程同機體其它部位的炎癥反應有相似之處，但也有其獨特性。T淋巴細胞在脊髓損傷修

2、復中的具體作用及其機制目前尚不十分清楚。本研究采用無胸腺裸鼠、胸腺摘除小鼠和CD4抗體注射方法建立小鼠T淋巴細胞或CD4+T淋巴細胞缺失的動物模型，通過功能學評分、組織學染色、實時定量PCR等方法，探討T淋巴細胞在脊髓損傷修復中的作用。
　　實驗共分為如下三個部分：
　　第一部分
　　【目的】用小鼠脊髓夾傷模型，比較觀察BALB/c小鼠和BALB/c背景的無胸腺裸鼠（BALB/c-nude-/-小鼠，以下簡稱裸鼠）脊髓

3、損傷恢復情況。
　　【方法】6-8周雄性BALB/c小鼠和BALB/c-nude-/-小鼠，麻醉后行脊髓T8節(jié)段重度夾傷模型。損傷后用BMS評分評估小鼠后肢運動功能恢復情況；GFAP標記膠質(zhì)瘢痕，評估比較損傷區(qū)面積；NeuN標記神經(jīng)元，觀察損傷區(qū)及其周邊神經(jīng)元的存活情況；Luxol-Fastblue染色，觀察損傷后脊髓吻尾側(cè)端髓鞘變性情況。
　　【結(jié)果】BMS評分結(jié)果顯示小鼠脊髓損傷后隨時間推移后肢運動功能逐漸恢復，14d可

4、達至平臺期，其中裸鼠損傷后運動功能恢復在多個時間點都明顯好于對照的BALB/c小鼠。免疫組織化學結(jié)果顯示脊髓損傷后7d裸鼠損傷區(qū)面積（0.33±0.04mm2）明顯小于對照組（0.57±0.04mm2），縮小約42％。NeuN染色顯示小鼠脊髓損傷后7d損傷區(qū)吻尾側(cè)端0.8mm內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目明顯下降，在尾側(cè)端距離損傷區(qū)0.4mm處裸鼠存活神經(jīng)元數(shù)目略多于對照組，但無統(tǒng)計學差異。Luxolfastblue髓鞘染色顯示裸鼠損傷區(qū)及其周圍白質(zhì)病

5、變輕于對照的BALB/c小鼠。
　　第二部分
　　【目的】比較觀察BALB/c小鼠和裸鼠脊髓夾傷早期各時間點損傷區(qū)細胞因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、MIP-1和MCP-1的表達變化情況。
　　【方法】6-8周雄性BALB/c小鼠和裸鼠，麻醉后行脊髓T8節(jié)段重度夾傷模型，分別于術(shù)后6h、12h、24h、3d和7d取以損傷區(qū)為中心共5mm脊髓，用TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR檢測

6、上述各基因的表達情況。
　　【結(jié)果】小鼠脊髓損傷早期，損傷區(qū)促炎因子IL-1β、IL-6及趨化因子MCP-1、MIP-1急劇升高，6h內(nèi)即達高峰，隨后開始下降，3d內(nèi)歸于正常；而炎癥抑制因子IL-4早期不升反降，3d降至最低，IL-10在6h有輕微升高。BALB/c小鼠和裸鼠兩組之間這幾種細胞因子在各時間點的表達均無明顯差異。
　　第三部分
　　【目的】用新生鼠胸腺摘除手術(shù)和CD4單克隆抗體（克隆號：GK1.5）腹腔注

7、射的方法分別建立循環(huán)血中T淋巴細胞缺失和CD4+T淋巴細胞缺失的動物模型，進一步探討驗證第一部分結(jié)果。
　　【方法】新生0-3dBALB/c小鼠體視顯微鏡下摘除胸腺，由ICR母鼠代乳，飼養(yǎng)至6-8周成年，流式細胞術(shù)檢測脾臟內(nèi)T淋巴細胞以確定手術(shù)效果后，行脊髓夾傷手術(shù)，術(shù)后不同時間點用BMS評分評估小鼠后肢運動功能恢復情況。
　　將CD4雜交瘤細胞接種至裸鼠腹腔，制備含CD4單克隆抗體的腹水，注射入成年BALB/c小鼠，200

8、μl/次只（對照組給予等量0.01M無菌PBS），隔兩天注射一次，注射三次后流式細胞術(shù)檢測脾臟內(nèi)CD4+T淋巴細胞以確定作用效果。之后行脊髓夾傷手術(shù)，術(shù)后不同時間點用BMS評分評估小鼠后肢運動功能恢復情況。
　　【結(jié)果】脊髓損傷后隨時間推移后肢運動功能逐漸恢復，同正常BALB/c小鼠相比，胸腺摘除小鼠脊髓損傷后后肢運動功能BMS評分無明顯差異；同樣，和PBS注射組相比，CD4抗體注射組小鼠BMS評分也無明顯差異。
　　結(jié)論<

9、br>　　通過以上三部分實驗我們可得出以下結(jié)論：
　　1.脊髓損傷后無胸腺裸鼠在功能學和組織學上的恢復均明顯好于對照的BALB/c小鼠；
　　2.無胸腺裸鼠同對照的BALB/c小鼠相比，脊髓損傷后一周內(nèi)損傷區(qū)炎癥因子表達無明顯差異，均為促炎因子表達增加，炎癥抑制因子表達不變或減少，可能使損傷局部的炎癥反應呈擴大趨勢，從而導致繼發(fā)的炎癥損傷；
　　3.用新生鼠胸腺摘除手術(shù)和CD4抗體注射的方法去除小鼠血液循環(huán)中成熟的T淋