miR-206靶向ZFP580調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換研究.pdf

1、目的:調(diào)控血管平滑肌(VSMC)表型轉(zhuǎn)換是防治PCI術(shù)后再狹窄的新策略，microRNA作為VSMC表型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子，可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游靶基因的的表達從而影響VSMC的表型轉(zhuǎn)換。本組首先克隆的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞及VSMC的增殖及遷移而影響血管重塑。本組新近實驗證明:microRNA-206既可靶向調(diào)控ZFP580的表達，又可促進VSMC從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換。本實驗擬采用microRNA-up與mi

2、croRNA-down技術(shù)，觀察microRNA-206表達水平的變化對大鼠VSMC分化功能的影響，并驗證其可能的分子機制。
　　方法:提取分離大鼠VSMC，通過形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化法進行鑒定。生物信息學(xué)分析ZFP580與miR-206的結(jié)合位點。利用TGF-β（根據(jù)文獻參考選取2ng/ml）對大鼠VSMC進行不同時間點刺激，對照組選用等量的DMEM。Realtime-PCR測定miR-206的表達水平;Western-blot檢

3、測ZFP580、SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達水平;使用慢病毒過表達或低表達miR-206、慢病毒過表達或低表達ZFP580和應(yīng)用SB431542抑制劑后檢測相關(guān)指標(biāo);熒光素酶報告實驗(Luciferase)檢測miR-206與ZFP5803'UTR的結(jié)合作用。
　　結(jié)果:
　　(1)在大鼠VSMC加入適宜的TGF-β（根據(jù)文獻參考選取2ng/ml）進行預(yù)處理，分別刺激大

4、鼠VSMC6h、12h、24h、48h，對照組中加入等量的DMEM。利用Realtime-PCR測定miR-206的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12h的時候miR-206的水平降至最低點，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。Western-blot檢測ZFP580的表達水平，結(jié)果顯示同樣在12h時ZFP580的表達水平達到最高，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。故在隨后的實驗當(dāng)中，時間節(jié)點選取12h作為實驗刺激最佳時間點。

5、r>　　(2) SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表達水平:利用TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC不同時間點均導(dǎo)致phospho-Smad2/3的升高，隨著刺激時間的延長呈現(xiàn)著表達減少的趨勢。而Smad2/3的表達各組間無明顯差異。TGF-β可誘導(dǎo)大鼠VSMC由合成表型向收縮表型的轉(zhuǎn)換，促進VSMC的分化，在實驗當(dāng)中隨著TGF-β的刺激，平滑肌細(xì)胞的分化標(biāo)記物SMa-actin、SM22

6、a與對照組相比表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　(3) SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導(dǎo)致的ZFP580、SMa-actin、SM22a表達水平的升高:選取20μM的SB431542對VSMC進行預(yù)處理，2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h，對照組加入等量DMSO預(yù)處理細(xì)胞余處理相同，以空白對照組為參照。從結(jié)果當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，在預(yù)先加入SB431542之后明顯降低了TGF-β(2ng/ml)誘導(dǎo)Z

7、FP580的表達上調(diào)(P＜0.05)， phospho-Smad2/3的表達水平較對照組明顯降低(P＜0.05）。與此同時，Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達水平結(jié)果顯示:SMa-actin、SM22a的表達較對照組相比均不同程度的降低(P＜0.05)。
　　(4) SB431542減少TGF-β(2ng/ml)刺激導(dǎo)致的miR-206水平的下調(diào):選取20μM的SB431542對VSMC進行預(yù)處理，2

8、h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h，隨后利用Realtime-PCR測定miR-206的表達水平，結(jié)果顯示miR-206的表達水平較對照組上調(diào)了大約2.5倍(P＜0.05）。
　　(5)慢病毒過表達miR-206:攜帶miR-206基因慢病毒載體按10MOI感染大鼠VSMC72小時后，在倒置熒光顯微鏡488nm激發(fā)光下觀察綠色熒光產(chǎn)生情況，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達到80％以上，Realtime-PCR檢測VSMC中miR

9、-206的基因表達水平。結(jié)果顯示Lv-GFP組與對照組相比沒有明顯差異(P＜0.05），Lv-mo-miR-206轉(zhuǎn)染組與對照組組相比，miR-206的基因表達水平顯著增高(P＜0.05）。在慢病毒轉(zhuǎn)染后，加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h，對照組選取正常的VSMC加入等量的TGF-β(2ng/ml)。在隨后的結(jié)果中發(fā)現(xiàn):Western-blot檢測SMa-actin、SM22a的表達水平對比對照組顯著降低(P＜0.05）

10、。而miR-206的基因表達水平較對照組降低(P＜0.05)。
　　(6)過表達或低表達miR-206慢病毒感染大鼠VSMC72h后，。Western-blot檢測ZFP580的表達水平，結(jié)果顯示:Lv-mo-miR-206感染組與對照組相比，ZFP580的表達水平下調(diào)(P＜0.05），miR-206低表達感染組與對照組相比，ZFP580的表達水平顯著上升(P＜0.05）。
　　(7)過表達或低表達ZFP580慢病毒感染大鼠

11、VSMC72h后。Western-blot檢測ZFP580的表達水平，結(jié)果顯示:高表達ZFP580感染組與對照組相比，SMa-actin與SM22a的表達水平上調(diào)(P＜0.05)，低表達ZFP580感染組與對照組相比，SMa-actin、SM22a的表達水平顯著上升(P＜0.05）。
　　(8)熒光素酶報告實驗(Luciferase)對miR-206與ZFP580進行外源性驗證:克隆ZFP580的3'UTR區(qū)域，構(gòu)建到熒光素酶報告

12、基因載體pGL-3M中。293細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206過表達及對照病毒，隨后將報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV在脂質(zhì)體lipofecfin2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206過表達的293細(xì)胞。48h后，檢測Luciferase活性，結(jié)果顯示:miR-206過表達組pGL-3M的報告活性顯著降低，提示miR-206可與ZFP580的3'UTR區(qū)域結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　TGF-β可以促進平滑肌細(xì)胞由合成型向收縮型轉(zhuǎn)換