線粒體功能相關(guān)因子在血管平滑肌細(xì)胞表型改變中的作用.pdf

1、目的： 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦血管意外等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，曾有多種學(xué)說從不同角度進(jìn)行探討，但至今尚未完全明了。目前發(fā)現(xiàn)，在各種因素的作用下發(fā)生粥樣硬化的動(dòng)脈中，平滑肌細(xì)胞表型的改變、增殖和遷移是病理過程的重要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚秃蟮钠交〖?xì)胞可分泌多種生長(zhǎng)因子，使自身和周圍細(xì)胞大量增殖，并最終導(dǎo)致動(dòng)脈管腔狹窄，粥樣斑塊和纖維帽的形成。何種因素啟動(dòng)了平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化目前仍不十分清楚

2、，可能與多種生長(zhǎng)因子、代謝產(chǎn)物等因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在平滑肌細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型的過程中，一些細(xì)胞器，如核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及線粒體等大量增加，線粒體的增加尤為顯著，猜測(cè)可能與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂，以及分泌都需要氧化磷酸化提供大量的能量有關(guān)。但線粒體在動(dòng)脈粥樣硬化的形成及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中的確切作用還不清楚。線粒體在功能改變時(shí)，先是線粒體DNA的表達(dá)發(fā)生轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變受核基因和線粒體基因共同調(diào)控，與其有關(guān)的基因很多，目前認(rèn)

3、為線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)是線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的關(guān)鍵因子，核基因通過調(diào)節(jié)mtTFA而調(diào)控線粒體的功能，啟動(dòng)線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程相關(guān)因子的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。mtTFA受核呼吸因子(NRF)的調(diào)節(jié)，有研究表明在寒冷或缺氧的條件下，NRF表達(dá)顯著增加，同時(shí)上調(diào)mtTFA，增加線粒體DNA復(fù)制，進(jìn)而增加氧化磷酸化提供能量，以維持細(xì)胞的功能。近年來(lái)有研究表明，過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子(PGC—1)參與細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的代

4、謝過程，可以與多種核受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。為了能明確線粒體功能在動(dòng)脈粥樣硬化病理發(fā)生中的作用，了解其調(diào)控的可能機(jī)制，我們應(yīng)用動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)探討可能的病理機(jī)制。 方法： 一、血管平滑肌細(xì)胞表型改變與線粒體功能調(diào)節(jié)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 1、動(dòng)物模型建立 雄性健康大耳白兔38只。動(dòng)物模型建立及分組：將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為4組。正常對(duì)照組(C)8只，喂飼基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組(AS模型組)30只，每組10只，

5、喂飼含2％膽固醇，8％豬油，4％蛋黃粉高脂飼料。 2、血液生化指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始及第4、8、12周末由兔耳緣靜脈抽血測(cè)血清總膽固醇(TC)，甘油三脂(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL—C)濃度，低密度脂蛋白膽固醇(LDL—C)濃度。指標(biāo)測(cè)定由遼寧中醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀完成。 3、標(biāo)本取材 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)及第4、8、12周末，分別取實(shí)驗(yàn)組8只，取出主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈縱行剪開，選擇主動(dòng)脈弓處取材。根據(jù)不

6、同實(shí)驗(yàn)技術(shù)和檢測(cè)指標(biāo)，取材標(biāo)本應(yīng)用不同的方法處理和保存。 4、主動(dòng)脈血管壁形態(tài)學(xué)觀察 取已用福爾馬林固定的主動(dòng)脈弓標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，HE染色鏡檢觀察主動(dòng)脈動(dòng)脈病理變化。 5、PGC—1、NRF—1、mtTFA及SMemb的mRNA水平測(cè)定(RT-PCR法) 總RNA提取，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸OD值，將原液核酸配成1μg/μl濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：PCR儀按94℃2min，94℃40s，57℃40s，7

7、2℃1min的條件循環(huán)35次，完成PCR反應(yīng)。 6、PGC—1、NRF—1、mtTFA及SMemb的蛋白水平測(cè)定(Western—blot法) 將主動(dòng)脈新鮮組織塊在生理鹽水中漂洗后，放入EP管中—70℃保存；實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入相應(yīng)體積的裂解液，將樣品剪碎后勻漿，離心收集上清；取上清10μl，檢測(cè)蛋白濃度(測(cè)OD值)；按說明書進(jìn)行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜。掃描儀掃描印記膜。 二、平滑肌細(xì)胞增殖的干預(yù)實(shí)驗(yàn) 1、細(xì)胞培養(yǎng)

8、 人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞加入培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q一次液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80％左右時(shí)，用0.1％胰蛋白酶消化傳代，第3～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2、實(shí)驗(yàn)分為四組 (1)正常對(duì)照組予以常規(guī)培養(yǎng)基。(2) oxLDL組，常規(guī)培養(yǎng)基中加入oxLDL使其終濃度達(dá)到10μg/ml作用24小時(shí)(3)棕櫚酸組，在(2)組方法的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基中加入棕櫚酸使其終濃度達(dá)到0.75 mmol/l作用24小時(shí)。(4)疊

9、氮鈉組，在(2)組方法的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基中加入疊氮鈉使其終濃度達(dá)到32mmol/L作用24小時(shí)。 3、各組PGC—1、NRF—1及mtTFA的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，應(yīng)用Western—blot方法。 4、線粒體提取及功能測(cè)定線粒體提取功能測(cè)定，按試劑盒說明進(jìn)行操作。 5、 MTT染色法檢測(cè)細(xì)胞活性 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下選擇波長(zhǎng)490nm測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖率(％)=(實(shí)驗(yàn)組OD值—對(duì)照組OD值)/

10、對(duì)照組OD值×100％。 6、增殖細(xì)胞核抗原PCNA免疫組化檢測(cè) SABC法免疫組化檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞之增殖細(xì)胞核抗原PCNA。 結(jié)果： 一、平滑肌細(xì)胞表型改變與線粒體調(diào)控相關(guān)因子的檢測(cè)結(jié)果 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀態(tài) 實(shí)驗(yàn)過程中各組動(dòng)物同期體重增加無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2、不同時(shí)間的血脂測(cè)定結(jié)果 隨著喂飼高脂飼料的時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)物血清中血脂含量水平呈上升趨勢(shì)，其中膽固醇、低

11、密度脂蛋白水平濃度增加顯著。 3、不同時(shí)期動(dòng)脈內(nèi)膜與中膜的厚度及內(nèi)膜與中膜比值 內(nèi)膜在4W、8W、12W逐漸增厚，中膜在8W、12W增厚，內(nèi)膜/中膜逐漸增加。 4、 PGC—1、NRF—1、mtTFA、SMemb的RT-PCR結(jié)果 PGC—1的mRNA表達(dá)在4W、8W、12W與喂飼高脂食物前比較差異有顯著性(p<0.01)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(p<0.01)。 NRF—1的mR

12、NA表達(dá)在4W，與喂高脂食物前比較差異顯著性(p<0.01)，8W以后其表達(dá)趨于平穩(wěn)，8W和12W與4W比較差異亦有顯著性。而8W與12W比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。 mtTFA的mRNA表達(dá)與NRF—1趨于同步升高。 SMemb的mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4個(gè)時(shí)間段比較，差異均有顯著性(p<0.01)。 5、 PGC—1、NRF—1、mtTFA、SMemb的Westernblot

13、測(cè)定結(jié)果 PGC—1的蛋白表達(dá)4W、8W、12W與0W比較差異有顯著性，其中4W與8W、12W比較差異有顯著性(p<0.01)，而8W、12W比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。 NRF—1的蛋白表達(dá)在4W與0W比較差異有顯著性(p<0.01)，8W、12W與0W、4W差異有顯著性(p<0.01)。而8W與12W比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。 mtTFA的蛋白表達(dá)在4W與0W比較差異顯著性(p<0.05)

14、，8W、12W與0W、4W差異有顯著性(p<0.05)。而8W與12W比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。 SMemb蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)亦呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與其mRNA水平改變一致。 二、平滑肌細(xì)胞增殖干預(yù)與線粒體功能改變的檢測(cè)結(jié)果 1、不同干預(yù)因素作用下，PGC—1/NRF—1/mtTFA蛋白水平改變 Ox—LDL組PGC—1、NRF—1、mtTFA蛋白表達(dá)增加(p<0.05)，棕櫚酸組與ox—LDL組比

15、較PGC—1、NRF—1、蛋白表達(dá)減少(p<0.05)，疊氮鈉組與ox—LDL組比較PGC—1、NRF—1、mtTFA蛋白表達(dá)是增加的(p<0.05)。 2、不同干預(yù)因素作用下，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性改變 Ox—LDL組與對(duì)照組比較明顯升高(p<0.05)，棕櫚酸組與oxLDL組比較COX活性降低(p<0.05)，疊氮鈉組與oxLDL組比較明顯降低(p<0.01)。 3、不同干預(yù)因素作用下，細(xì)胞增殖活性的改

16、變 oxLDL促進(jìn)細(xì)胞增殖(p<0.05)，棕櫚酸組抑制細(xì)胞增殖(p<0.05)，應(yīng)用疊氮鈉后可以抑制細(xì)胞增殖(p<0.01)。 4、不同干預(yù)因素下平滑肌細(xì)胞PCNA的檢測(cè)結(jié)果 Ox—LDL組與對(duì)照組比較，PCNA蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.05)，棕櫚酸組、疊氮鈉組PCNA蛋白表達(dá)均明顯減弱，與ox—LDL組比較差異有顯著性(p<0.01)。 結(jié)論： 動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞表型由收縮型變?yōu)楹铣尚驮?/p>

17、粥樣硬化的形成中起著重要的作用。 1、在本實(shí)驗(yàn)中平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變過程中，NRF—1的表達(dá)也在逐漸升高，與mtTFA成明顯正相關(guān)。二者的表達(dá)增高和相互作用，共同調(diào)節(jié)線粒體功能，在平滑肌細(xì)胞表型改變中起著重要作用。 2、隨著平滑肌表型的改變，合成型平滑肌細(xì)胞不斷增加，PGC—1也隨著增加，并且與NRF—1成正相關(guān)，針對(duì)PGC—1的干預(yù)同樣下調(diào)了NRF—1，說明二者存在內(nèi)在的聯(lián)系。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中可能是PGC—1啟動(dòng)了N