miR-206調(diào)控ANXA2在PASMCs表型轉(zhuǎn)換中的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　“肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)表型轉(zhuǎn)換”是肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)進(jìn)程中重要病理生理改變之一。HPS是慢性肝病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，以肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張、動脈血氧和作用異常為主要表現(xiàn)。因為既往診斷標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一，肝肺綜合征在肝硬化患者中的發(fā)病率從4％到47％不等，確診后2.5年死亡率達(dá)到了41

2、％。因為對肝肺綜合征具體發(fā)病機(jī)制還不是太清楚，目前尚缺乏有效的治療藥物，原位肝移植被認(rèn)為是唯一有效的治療方式。過去的研究已經(jīng)表明肺血管重塑在肝肺綜合征發(fā)病機(jī)制中扮演了重要作用。在肺血管重塑發(fā)展過程中，肺動脈平滑肌細(xì)胞由靜止型（收縮型）向合成型（分泌型）轉(zhuǎn)化;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞分化是兩個基本的病理生理改變。因此，明確肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，可以進(jìn)一步促進(jìn)我們對肝肺綜合征的了解。膜聯(lián)蛋白A2(Annexins A2，

3、ANXA2)是鈣依賴磷酸結(jié)合蛋白超家族的一員。在許多惡性腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，遷移，骨架形成，血管生成，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌。目前我們的研究表明，ANXA2在肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中起了重要作用。MicroRNAs(miRNAs)，是一種小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過程。在肺血管重塑的發(fā)展進(jìn)程中，某些特定階段miRNAs的表達(dá)參與PASMCs表型轉(zhuǎn)化在其中發(fā)揮著重要的作用。鑒于轉(zhuǎn)錄水平

4、的調(diào)控ANXA2表達(dá)的作用并不明顯，我們推測是否存在潛在的miRNAs通過調(diào)節(jié)ANXA2基因的表達(dá)參與了肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。
　　方法:
　　實驗分五部分
　　1.構(gòu)建HPS大鼠模型并制備血清，培養(yǎng)原代PASMCs
　　采用慢性膽總管結(jié)扎構(gòu)建HPS大鼠模型，2周后行病理切片及血?dú)夥治觯晒笾苽溲?。采用組織塊法培養(yǎng)原代PASMCs。
　　2.生物信息學(xué)分析，HPS大鼠血清刺激PASMCs后對SMα-

5、actin、ANXA2和miRNA-206表達(dá)進(jìn)行檢測
　　生物信息學(xué)分析預(yù)測可能靶向作用于ANXA23'-UTR的miRNAs。PASMCs隨機(jī)分為2組:對照組（C組）和HPS干預(yù)組（HPS組），分別接受5％正常大鼠血清或HPS大鼠血清孵育24、48和72h后，采用western blot法分別檢測ANXA2，SMα-actin表達(dá);qRT-PCR檢測ANXA2 mRNA和miRNAs的表達(dá)。
　　3.PASMCs轉(zhuǎn)染以及

6、ANXA2，SMα-actin的免疫熒光檢測
　　PASMCs分別轉(zhuǎn)染miR-206 mimic，miR-206 inhibitor或ANXA2過表達(dá)質(zhì)粒。采用western blot法分別檢測ANXA2，SMα-actin表達(dá)，及采用免疫熒光對ANXA2，SMα-actin細(xì)胞內(nèi)定位。qRT-PCR檢測ANXA2 mRNA的表達(dá)。
　　4.雙熒光素酶報告基因檢測
　　雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-206是否通過直

7、接結(jié)合到ANXA2mRNA的3′-UTR，抑制ANXA2的表達(dá)。
　　5.3H-Thymidine(3H-TdR)摻入法和CCK-8法檢測
　　將miR-206 mimic和（或）ANXA2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肺動脈平滑肌細(xì)胞，3H-TdR摻入法和CCK-8法觀察其對HPS大鼠血清刺激導(dǎo)致的增殖效應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.HPS大鼠血清對肺動脈平滑肌細(xì)胞miR-206 and ANXA2的影響。
　　生物信

8、息學(xué)軟件分析預(yù)測miRNA-206可以結(jié)合到ANXA2基因的3′-UTR。在肝肺綜合征大鼠血清刺激組，miR-206與ANXA2的表達(dá)在不同的時間點呈負(fù)相關(guān)。
　　2.miR-206調(diào)節(jié)PASMCs表型轉(zhuǎn)化。
　　PASMCs在轉(zhuǎn)染miR-206mimic，miR-206 inhibitor后，表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白SMα-actin與miR-206的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　3.miR-206直接結(jié)合ANXA2 mRNA3'

9、-UTR抑制ANXA2表達(dá)。
　　miRNA功能分析和熒光素酶報告基因檢測表明，miRNA通過直接結(jié)合到ANXA2mRNA的3'-UTR，抑制ANXA2的表達(dá)。
　　4.miR-206/ANXA2通路介導(dǎo)HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和增殖。
　　miR-206有效的抑制了HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖。然而，這種效應(yīng)可以在過表達(dá)ANXA2的情況下逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　本研究表