ZFP580在ROS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用.pdf

1、目的：氧化應(yīng)激(oxidativestress)是由于機(jī)體活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生增多與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)應(yīng)起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)。對(duì)人類(lèi)而言，氧化應(yīng)激涉及許多疾病，如帕金森氏病和阿茲海默病等。在心血管系統(tǒng)疾病中，如心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia/reperfusioninjury，MI/RI)、動(dòng)脈粥樣硬化及高血壓等均發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷。而ROS作為氧化應(yīng)激的核心成

2、分，在該過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。ROS既可以直接引起組織細(xì)胞損傷，又可以通過(guò)有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK通路、NF-KB通路等間接引起生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)，MAPK通路在氧化應(yīng)激中的作用日益受到關(guān)注。本組在前期的研究工作中篩選人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)，得到一個(gè)cDNA全長(zhǎng)為1726bp的鋅指蛋白新基因ZNF580。該基因編碼172個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其N(xiāo)端為脯氨酸富含域，C端為含有三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，其蛋白結(jié)構(gòu)與Sp/

3、KLF家族成員相似。ZFP580是本試驗(yàn)室隨后克隆的與ZNF580同源的鼠源性基因。本組通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，H2O2可以誘導(dǎo)ZNF580表達(dá)升高，且ZNF580可以受到NF-KB及P38MAPK通路的調(diào)節(jié)。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)H2O2體外刺激H9C2大鼠心肌細(xì)胞探討ZFP580在ROS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。
　　方法:使用不同劑量H2O2刺激H9C2細(xì)胞不同時(shí)間，篩選適宜的刺激濃度及時(shí)間，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基

4、。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；檢測(cè)細(xì)胞上清中LDH活性；Realtime-PCR測(cè)定ZFP580、IL-6及TNF-αmRNA表達(dá)水平；Western-blot檢測(cè)ZFP580、P38MAPK、phospho-P38MAPK、caspase3及cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)；使用慢病毒過(guò)表達(dá)ZFP580后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)p38MAPK的特異性阻滯劑SB303580觀察P38MAPK磷酸化對(duì)H2O2誘導(dǎo)ZFP58

5、0表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)適宜H2O2刺激濃度的選定：根據(jù)文獻(xiàn)選取H2O2200μmol/L為刺激濃度，分別刺激H9C2細(xì)胞30min、1h、2h，4h、6h，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2200μmol/L刺激2h，4h、6h后細(xì)胞活性明顯減低與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。以H2O2刺激2h為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，分別以100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μ

6、mol/L刺激H9C2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨刺激濃度的增加細(xì)胞活性明顯減低，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而以H2O2200μmol/L刺激H9C2細(xì)胞15min、30min、1h、2h后，分別檢測(cè)細(xì)胞上清LDH活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比H2O2200μmol/L刺激15min后即可造成細(xì)胞損傷。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)H2O2刺激濃度為200μmol/L時(shí)間選定為2h以?xún)?nèi)。
　　(2)ZFP580的表達(dá)：以空白對(duì)照組為參照。H2O2刺激不同

7、時(shí)間點(diǎn)均可引起ZFP580mRNA表達(dá)水平升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。H2O2200μmol/L刺激15min后，ZFP580mRNA表達(dá)達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比上調(diào)14倍。ZFP580蛋白在H2O2刺激不同時(shí)間點(diǎn)也呈上調(diào)趨勢(shì)，H2O2200μmol/L刺激30min后達(dá)到峰值，ZFP580蛋白表達(dá)上調(diào)2.5倍，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(3)P38MAPK、phospho-P38MAPK的

8、表達(dá)：以空白對(duì)照組為參照，為單位1。H2O2刺激不同時(shí)間點(diǎn)均可引起phospho-P38MAPK表達(dá)水平升高而P38MAPK表達(dá)各組無(wú)明顯差異。以相應(yīng)組的phospho-P38MAPK與P38MAPK比值作為統(tǒng)計(jì)量來(lái)表示P38MAPK氧化應(yīng)激后的磷酸化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比P38MAPK的磷酸化主要發(fā)生在刺激后的30min、1h及2h。將phospho-P38MAPK/P38MAPK比值與ZFP580蛋白表達(dá)行Pearson相關(guān)分析

9、發(fā)現(xiàn)，二者具有明顯相關(guān)性(r=0.818，P＜0.01)。
　　(4)SB203580抑制H2O2引起的ZFP580蛋白表達(dá)：H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)SB20358010μmol/L預(yù)處理30min后，以H2O2200μmol/L刺激細(xì)胞30min，對(duì)照組加入等量DMSO預(yù)處理細(xì)胞余處理相同，以空白對(duì)照組為參照，為單位1。結(jié)果顯示，SB203580可以明顯減少H2O2所引起的P38MAPK的磷酸化以及H2O2所引起的ZFP580蛋白的上

10、調(diào)(P均<0.05)。
　　(5)慢病毒介導(dǎo)的ZFP580過(guò)表達(dá)：使用慢病毒包裝載體使H9C2心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)ZFP580，設(shè)空載病毒的陰性對(duì)照。Western-blot結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后ZFP580成功在H9C2細(xì)胞中被高表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，分別給予H2O2200μmol/L刺激30min或不給予刺激，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6mRNA和TNF-αmRNA在過(guò)表達(dá)ZFP580細(xì)

11、胞中均可被上調(diào)，與相應(yīng)的陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(6)SB203580減少H2O2誘導(dǎo)的TNF-αmRNA及IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)：以H2O2200μmol/L刺激H9C2細(xì)胞15min、30min、1h、2h后，qPCR結(jié)果顯示TNF-αmRNA在刺激30min、1h、2h時(shí)表達(dá)被上調(diào)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。IL-6mRNA在刺激15min、30min時(shí)表達(dá)被上調(diào)，與對(duì)照組相比有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。使用SB20358010μmol/L預(yù)處理細(xì)胞30min，然后分別以H2O2200μmol/L刺激細(xì)胞30min及1h，觀察IL-6mRNA及TNF-αmRNA表達(dá)，結(jié)果顯示SB203580可以減少H2O2引起的TNF-αmRNA及IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　(7)細(xì)胞過(guò)表達(dá)ZFP580后可減少H2O2引起的細(xì)胞凋亡：使用慢病毒過(guò)表達(dá)ZFP580，陰性對(duì)照組加入等量空載病毒，而后以H

13、2O2200μmol/L激H9C2細(xì)胞2h，AnnexinV-PE/7-AAD染色后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ZFP580的心肌細(xì)胞H2O2刺激后的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)。Western-blot檢測(cè)caspase3及cleaved-caspase3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ZFP580組細(xì)胞在H2O2刺激后的caspase3及cleaved-caspase3的表達(dá)明顯減少，較陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜