HIF2α在肝癌中的表達(dá)及其降解相關(guān)的HIF2α-VHL結(jié)構(gòu)建立.pdf

1、論文題目：H!里2垡在旺疸生的麥達(dá)壁甚隆鯉擔(dān)差的HIF20t—VHL結(jié)構(gòu)建立答辯委員會主席：豳笙答辯委員會成員：』瑩噩，盞筠壑鰓溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HIF2a在肝癌中的表達(dá)及其降解相關(guān)的HIF2aVHL結(jié)構(gòu)建工一業(yè)中文摘要目的：本文目的主要包括以下三個方面：1，確認(rèn)肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)患者的肝癌組織及癌旁組織中缺氧誘導(dǎo)因子2吐(hypoxiainduciblefactor2a，HIF2

2、a)的表達(dá)情況：2，構(gòu)建HIF2aVHL復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)模型，分析HIF2n與希佩爾林道腫瘤抑制蛋白(vonHippel—Lindau，VHL)之間的相互作用以便深入了解HIF2a在體內(nèi)降解時被VHL識別的過程；3，比較HIF2a—VHL復(fù)合物與HIFlaVHL晶體結(jié)構(gòu)(proteindatabank，PDB)(PDBID：ILQB)的異同，為未來基于HIF2a降解相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來設(shè)計靶向分子藥物提供依據(jù)。方法：提取64例肝癌組織、癌

3、旁組織和2例正常肝臟組織中的DNA和RNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)方法對DNA中隨機(jī)挑選的HIF2a基因3號、9號、12號外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription—PC＆RTPCR)方法合成cDNA，對cDNA中的HIF2a進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果：分別對肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織用HIF2a抗體進(jìn)行免疫組化染色，顯

4、微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果；HIF2a的氨基酸序列信息從UniProt數(shù)據(jù)庫中獲取，其結(jié)構(gòu)域信息從Pfam數(shù)據(jù)庫中獲得，為獲得用于同源性建模的HIF2aC末端氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(Cterminaloxygendependentdegradationdomain，CODD)(第516550位氨基酸)的結(jié)構(gòu)，使用proteinproteinBLAST(Blastp)和positionspecificiteratedBLAST(PSIBLAsT)

5、工具在HIF2aCODD序列與PDB數(shù)據(jù)庫中多個結(jié)構(gòu)的序列之問進(jìn)行相似性搜索?；贐lastp和PSIBlast的結(jié)果，用ICMPro軟件中的ICMmodeling程序?qū)IF2aCODD進(jìn)行同源性建模，分析同源建模的結(jié)果，構(gòu)建HIF2a—VHL初始結(jié)構(gòu)模型：HIF2aCODD是HIF2a全長蛋白質(zhì)的一部分，而其中的第527542氨基酸又位于CODD的中間位置且在進(jìn)化中高度保守，因此，對HIF2a—VHL初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，實驗

6、設(shè)計如下：HIF2a第527—542位氨基酸固定一段時間，先讓兩端的第516526位和第543550位氨基酸移動到相對合理的位置，然后，把第516—550位所有的氨基酸放開進(jìn)行分子動力學(xué)模擬以獲得最合理的結(jié)構(gòu)。共設(shè)定4組條件，分別是：放開所有氨基酸，300K，32ns；放開所有氨基酸，310K，24ns：12ns固定部分氨基酸加44ns放開所有氨基酸，300K；28ns固定部分氨基酸加20ns放開所有氨基酸，300K。最終獲得的結(jié)構(gòu)與實