宮頸癌Hela細(xì)胞中HIF-2α基因的表達(dá)及相關(guān)研究.pdf

1、宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，其病死率在所有婦女癌癥病死率中占第二位。近年來宮頸癌發(fā)生率逐漸增多，且發(fā)病年齡越來越年輕化。宮頸癌的診斷方法與步驟已經(jīng)基本完善，但宮頸癌的治療還在不斷改進(jìn)之中。宮頸癌的治療目前一直維持在一個手術(shù)、化療、放療綜合治療的局面，治療效果沒有顯著改善。特別是晚期宮頸癌患者，治療效果不理想，生活質(zhì)量低，而且近年來又出現(xiàn)放療抵抗，化療耐藥等使得宮頸癌的治療處于瓶頸階段。如何治療宮頸癌，有效的改善療效，提高患者的治愈率

2、及生活質(zhì)量已經(jīng)成為宮頸癌研究中最關(guān)鍵的問題之一。
　　 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來多種腫瘤的治療已經(jīng)進(jìn)入到分子治療水平，少數(shù)針對有效靶基因的治療已經(jīng)被運用到部分腫瘤的臨床研究中，而宮頸癌的基因治療卻一直停滯于基礎(chǔ)研究階段。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個由多種基因共同作用的復(fù)雜過程，而微環(huán)境的改變使得各種基因表現(xiàn)出不同作用從而使得這個過程更加復(fù)雜。找到有效的基因，研究其在微環(huán)境中的變化，從而探討該基因?qū)τ谀[瘤的作用是我們需要研究的第一步。是

3、否能對該基因進(jìn)行有效干擾是該基因能否運用于臨床治療的前提。本研究希望能從腫瘤所存在的微環(huán)境出發(fā)，找到一個有效的靶基因，并能對該靶基因進(jìn)行有效干擾，最終希望能通過對該基因進(jìn)行干擾使宮頸癌的生物學(xué)行為發(fā)生改變，從而為臨床中宮頸癌治療或提高宮頸癌治療的療效提供依據(jù)。
　　 宮頸癌是人體內(nèi)的一種實體腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者中宮頸組織的PO2低于正常宮頸組織，而且隨著宮頸癌期別的增加，PO2的水平降低[1]。簡而言之，宮頸癌組織中存在缺

4、氧微環(huán)境。研究表明缺氧微環(huán)境在多種腫瘤的形成與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與到腫瘤細(xì)胞的代謝適應(yīng)、凋亡抵抗、血管生成和侵襲、轉(zhuǎn)移等各個方面。缺氧微環(huán)境對于腫瘤細(xì)胞的作用通過缺氧誘導(dǎo)因子家族(HIF)實現(xiàn)。目前已知的缺氧誘導(dǎo)因子包括HIF-1，HIF-2和HIF-3。每個因子都由不同的功能亞基和相同的結(jié)構(gòu)亞基組成。HIF-2α是HIF-2的功能亞基，于1997年發(fā)現(xiàn)，是近年來發(fā)現(xiàn)的最重要的缺氧誘導(dǎo)因子之一，目前研究較少，但已引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研

5、究者的廣泛重視，相關(guān)研究正在不斷展開。已經(jīng)有研究證實HIF-2α基因與肺癌，腎癌等關(guān)系密切，并且在這些腫瘤中HIF-2α基因所發(fā)揮的獨特作用是其他缺氧誘導(dǎo)因子所無法替代的[2，3]。還有研究指出HIF-2α基因表達(dá)具有組織特異性，并受周圍環(huán)境影響[4]。此外，HIF-2α基因還被發(fā)現(xiàn)在放療抵抗[26，27]，化療耐藥[28]中發(fā)揮了重要的作用，從而被認(rèn)為對于腫瘤的治療有重要意義。HIF-2α基因在宮頸癌中是否表達(dá)，其表達(dá)與是否受微環(huán)境影

6、響?HIF-2α基因能否被有效干擾?以及HIF-2α基因?qū)m頸癌的生物學(xué)行為是否有影響，微環(huán)境是否在這些影響中起作用?HIF-2α基因的靶基因有哪些，微環(huán)境是否對它的作用產(chǎn)生影響?這些問題在國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。
　　 本研究首先就宮頸癌Hela細(xì)胞株中HIF-2α基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并通過RNAi技術(shù)對HIF-2α基因進(jìn)行干擾，找出最佳干擾靶點，對Hela細(xì)胞中的HIF-2α進(jìn)行有效干擾后了解其相關(guān)基因的表達(dá)情況，以探討

7、HIF-2α在宮頸癌Hela細(xì)胞中的作用機制。最后將Hela細(xì)胞中HIF-2α進(jìn)行有效干擾后再進(jìn)行腫瘤相關(guān)基因檢測和細(xì)胞克隆及細(xì)胞侵襲實驗，以探討HIF-2α對于Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過本實驗希望能為臨床治療宮頸癌提供新的思路和方法。
　　 第一部缺氧及常氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)及HIF-2α表達(dá)水平的研究
　　 目的：
　　 本研究通過對常氧及缺氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖情況及HIF-2α

8、的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。擬探討與常氧相比，缺氧條件下Hela細(xì)胞的生長情況及HIF-2α mRNA的表達(dá)水平的改變趨勢。
　　 方法：
　　 檢測常氧及缺氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞的生長情況，并用MTT方法繪制生長曲線，運用real-time PCR方法檢測常氧及缺氧條件下HIF-2α mRSA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.(1).常氧條件下，Hela細(xì)胞的OD值從第1天開始明顯增高，于第5天到達(dá)峰值

9、(p<0.05)，而第7天、第9天的OD值略有降低，且第7天與第9天相比，OD值無明顯差別(p>0.05)。(2).缺氧條件下，Hela細(xì)胞OD值從第1天開始明顯增高，于第3天達(dá)到峰值，而從第5天開始，細(xì)胞的OD值明顯降低(p<0.05)
　　 2.Hela細(xì)胞常氧和缺氧條件下培養(yǎng)24小時后檢測HIF-2α mRNA水平，結(jié)果示：(1).缺氧條件下的Hela細(xì)胞HIF-2α mRNA的表達(dá)水平明顯增高(p<0.05)；(2).在

10、缺氧條件下培養(yǎng)第3天時HIF-2α mRNA的表達(dá)水平達(dá)到峰值(p<0.05)，第5天時略有下降，但與第3天HIF-2αmRNA表達(dá)無明顯差別(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.常氧條件下，Hela細(xì)胞的指數(shù)生長期是第1-5天，第7天至第9天細(xì)胞生長達(dá)到平臺期。缺氧條件下，Hela細(xì)胞的指數(shù)生長期是第1-3天，而從第5天開始，細(xì)胞OD值明顯下降(p<0.05)，提示Hela細(xì)胞可能不能長時間耐受缺氧狀態(tài)。

11、　　 2.缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞中HIF-2α mRNA表達(dá)增強；在缺氧誘導(dǎo)初期(第1-3天)HIF-2α mRNA表達(dá)有一定時間依賴性；第3-5天HIF-2α mRNA表達(dá)進(jìn)入平臺期。Hela細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)后期(第7-9天)大部分死亡，提示HIF-2α可能促進(jìn)Hela細(xì)胞生長，但其不能使Hela細(xì)胞長時間的耐受缺氧狀態(tài)。
　　 第二部分宮頸癌Hela細(xì)胞HIF-2α基因沉默效率的研究
　　 目的：

12、　　 本研究通過對以HIF-2α mRNA為靶序列的4組siRNA干擾序列進(jìn)行篩選，以構(gòu)建最有效的抑制HIF-2α基因表達(dá)的慢病毒載體，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 應(yīng)用RNAi設(shè)計軟件，設(shè)計針對HIF-2α mRN，A作用的4條siRNA的序列，并將其分別插入到慢病毒載體中，通過對病毒載體的包裝，獲得較高滴度的慢病毒后，采用兩種不同劑量的慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，運用RT-PCR和werstern blot

13、方法檢測HIF-2α mRNA及蛋白質(zhì)水平，以了解4條siRNA干擾效果。從而篩選出對HIF-2α基因沉默作用較強的干擾序列及病毒載體劑量。將兩種不同劑量的含有最佳干擾序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞后，運用real-time PCR方法檢測HIF-2α mRNA表達(dá)，驗證siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞中HIF-2α的沉默效果，并找到最佳病毒載體劑量。
　　 結(jié)果：
　　 1.4條siRNA序列均能干擾HIF-2α

14、基因表達(dá)，其中KD2序列對HIF-2α基因的干擾作用最強(p<0.05)。
　　 2.兩種不同劑量的慢病毒載體比較，高劑量慢病毒載體的干擾效果更明顯(0<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.4條siRNA序列均有沉默HIF-2α的作用，其中KD2序列的沉默作用最強(p<0.05)，提示KD2序列能有效沉默HIF-2α基因。
　　 2.高劑量的慢病毒載體對HIF-2α基因的沉默效果更強。
　　 第

15、三部分 HIF-2α基因沉默對Hela細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究
　　 目的：
　　 本研究通過對HIF-2α基因沉默前后，在常氧和缺氧條件下Hela細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)基因(cox-2、VEGF)表達(dá)的檢測，以及細(xì)胞克隆形成率和侵襲力的檢測，初步探討HIF-2α基因的沉默對Hela細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：
　　 在常氧和缺氧條件下，根據(jù)是否對HIF-2α基因干擾而將Hela細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組(CO

16、N組)、陰性轉(zhuǎn)染組(NC組)和轉(zhuǎn)染組(KD組)，運用real-time PCR方法檢測各組中HIF-2α，cox-2和VEGF的表達(dá)水平，運用限度稀釋克隆形成法檢測Hela細(xì)胞克隆形成率，運用腫瘤細(xì)胞侵襲試驗檢測Hela細(xì)胞侵襲力的強弱。
　　 結(jié)果：
　　 1.在Hela細(xì)胞中，經(jīng)siRNA沉默后HIF-2基因表達(dá)水平在常氧和缺氧環(huán)條件下均明顯降低(P<0.05)，但常氧和缺氧條件下比較HIF-2α mRNA水平無明顯

17、差異(P>0.05)。
　　 2.(1).常氧和缺氧條件下，cox-2 mRNA在未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)無明顯差異；(2).HIF-2α基因未沉默時，常氧與缺氧條件下的cox-2 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(p>0.05)；(3).常氧和缺氧條件下，HIF-2α基因沉默后，cox-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；但常氧與缺氧比較cox-2 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(p>0.05)。
　　 3.(1)

18、.常氧和缺氧條件下，VEGF mRNA在未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)無明顯差異(p>0.05)；(2)HIF-2α未沉默的Hela細(xì)胞中，VEGF在缺氧條件下的表達(dá)水平明顯高于常氧條件下表達(dá)(p<0.05)；(3).常氧條件下，HIF-2α基因沉默前后的Hela細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(p>0.05)；(4).缺氧條件下，HIF-2α基因沉默后VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯降低(p<0.05)；(5).HIF-2α

19、基因沉默后，在常氧和缺氧條件下VEGF表達(dá)水平無明顯差異(p>0.05)。
　　 4.(1).HIF-2α基因未沉默時，常氧與缺氧條件下的Hela細(xì)胞克隆形成率無明顯差異；(2)常氧和缺氧條件下，HIF-2α基因沉默后，Hela細(xì)胞的克隆形成率明顯降低；(3).HIF-2α基因沉默后，與常氧條件相比，缺氧條件下Hela細(xì)胞克隆形成率明顯減低。
　　 5.(1).HIF-2α基因未沉默的Hela細(xì)胞中，與常氧相比，缺氧條件

20、下的Hela細(xì)胞中侵襲力率明顯降低；(2).缺氧和常氧條件下，HIF-2α基因沉默后，Hela細(xì)胞侵襲力均明顯減低；(3).HIF-2α基因沉默后，與常氧條件相比，缺氧條件下的Hela細(xì)胞侵襲力無明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.Hela細(xì)胞中HIF-2α能被有效沉默且不受缺氧因素的影響；
　　 2.常氧和缺氧條件下HIF-2α基因沉默均可導(dǎo)致cox-2基因表達(dá)下調(diào)。
　　 3.常氧條件下HIF-2α基