HIF-1a及其調(diào)控因子PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)其影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，其雖是良性病變，但有惡性腫瘤的生物學(xué)行為，目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。課題組前期研究表明:HIF-1a（缺氧誘導(dǎo)因子-1a）在子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)升高，證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)HIF-1a與惡性腫瘤的生物表達(dá)學(xué)特性之間的關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)調(diào)控途徑有VHL腫瘤抑制蛋白途徑、MAPK途徑、PI3K途徑、RACK1途徑。因HIF-1a在子宮內(nèi)膜異

2、位癥的表達(dá)增強(qiáng)，HIF-1a表明不被降解。而在常氧條件下的調(diào)控途徑是VHL腫瘤抑制蛋白途徑;PHD（脯氨酸羥化酶）是一種氧傳感器，是HIF-1a降解的關(guān)鍵限速酶，研究發(fā)現(xiàn)VHL蛋白能識(shí)別并結(jié)合564位脯氨酸被羥化的HIF-1a，而脯氨酸羥化酶PHD2能特異性羥化HIF-1a氧依賴降解結(jié)構(gòu)中Pro-564，鑒于以上研究，我們分析因子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)，在乏氧條件下，PHD不能被活化，不能從蛋白質(zhì)含量和轉(zhuǎn)錄活性兩個(gè)方面介導(dǎo)HIF-1a

3、，HIF-1a不能被降解;同樣在乏氧條件下，VHL（希佩爾林道抑癌基因）不能識(shí)別HIF-1a亞基致其不被降解而活性增強(qiáng)。那么在子宮內(nèi)膜異位癥中PHD2、VHL如何調(diào)控HIF-1a及相互間的關(guān)系研究尚未見(jiàn)報(bào)道。既然子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)，那么深入研究其乏氧調(diào)控可以進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)明確內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制有重要意義。目前其缺乏有效的治療，前期的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥療效確定，那么該方是否通過(guò)影響VH

4、L基因蛋白及PHD2羥化酶而起到治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
　　目的:
　　通過(guò)臨床研究HIF-1a及其調(diào)控因子PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位組織中的表達(dá)，探討PHD2、VHL與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的關(guān)系;觀察補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表達(dá)的影響，研究補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、HI

5、F-1a及其調(diào)控因子PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)組:選取2013年9月至2014年8月在河北省中醫(yī)院、河北省醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、石家莊市六院患子宮內(nèi)膜異位癥而行腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)治療的患者20例，術(shù)中留取同一患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜新鮮組織（患者簽署知情同意書(shū)），術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為子宮內(nèi)膜組織。術(shù)前3個(gè)月未用過(guò)激素治療，年齡26-39歲，平均34.0±3.77歲。對(duì)照組:收集同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者的子

6、宮肌瘤及正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組，且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為子宮肌瘤及正常子宮內(nèi)膜組織?；颊吣挲g30-40歲，平均年齡:35.1±3.87歲。兩組患者年齡分布均衡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。采用免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1a mRNA、PHD2 mRNA、VHL mRNA的表達(dá)。
　　2、腎陽(yáng)

7、虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的建立
　　模擬婦科“冒雨涉水，感受寒邪”的病因，依據(jù)“寒邪傷陽(yáng)”的中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合傳統(tǒng)的“自體移植”子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型，以建立病證結(jié)合的“腎陽(yáng)虛血瘀證”子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型。依據(jù)冷凍時(shí)間長(zhǎng)短及前后順序行3種不同的方法造模，方法如下:冷凍1個(gè)月，行子宮內(nèi)膜異位癥造模，再冷凍1個(gè)月設(shè)為“冷凍+造模+冷凍”組;冷凍1個(gè)月，行子宮內(nèi)膜異位癥造模后不冷凍為“冷凍+造?！苯M;先不冷凍，行子宮內(nèi)膜異位癥造模

8、后，繼續(xù)冷凍1個(gè)月，設(shè)為“造模+冷凍”組，另設(shè)空白對(duì)照組。用大鼠宏觀表現(xiàn)及理化檢驗(yàn)指標(biāo)評(píng)價(jià)該模型的臨床符合度。
　　3、補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表達(dá)的影響
　　將50只SD大鼠分為空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）、假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只。其中對(duì)照組、假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、中藥組、西藥組采用“延長(zhǎng)冰箱冷凍加冰水浸泡”30天，再結(jié)合“自體移植法”創(chuàng)建內(nèi)異癥

9、腎陽(yáng)虛血瘀證模型，術(shù)后給予中藥組補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方、西藥組孕三烯酮灌胃，模型組、對(duì)照組、假手術(shù)組灌服等體積的生理鹽水，造模4周后觀察大鼠異位灶大小及形態(tài)，HE染色光鏡觀察子宮在位內(nèi)膜及異位組織形態(tài)學(xué)的變化，免疫組化SABC法、Western blotting檢測(cè)HIF-1a、PHD2、VHL蛋白，RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1a mRNA、PHD2mRNA、VHL mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、HIF-1a、PHD2、VH

10、L在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)
　　1.1 免疫組化法檢測(cè)異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常子宮內(nèi)膜組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　1.1.1 HIF-1a的表達(dá)
　　HIF-1a的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀，在異位組織中細(xì)胞排列紊亂，上皮細(xì)胞染色淺，腺體上皮細(xì)胞變薄;在位組腺體相對(duì)清晰，陽(yáng)性細(xì)胞染色較深，子宮肌瘤組織中細(xì)胞排列紊亂，無(wú)完整腺體，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞收縮、壞死，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)淺。在正常子宮內(nèi)膜組

11、腺體完整，陽(yáng)性細(xì)胞染色淺。
　　1.1.2 PHD2的表達(dá)
　　PHD2的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒。異位內(nèi)膜組腺體完整，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)淺;在位內(nèi)膜組腺體完整，上皮細(xì)胞薄，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)淺;子宮肌瘤組無(wú)完整腺體，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)深;正常內(nèi)膜組:腺體完整，細(xì)胞排列緊密，陽(yáng)性細(xì)胞染色深。PHD2在各組表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。
　　1.1.3 VHL的表達(dá)
　　VHL陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒

12、。異位內(nèi)膜組表現(xiàn)為腺體不完整，陽(yáng)性細(xì)胞染色淺;在位內(nèi)膜組:腺體較完整，細(xì)胞染色淺;子宮肌瘤組:腺體不完整，上皮細(xì)胞薄，呈扁平狀，陽(yáng)性細(xì)胞染色較深;正常內(nèi)膜組:腺體完整，上皮細(xì)胞呈柱狀，結(jié)締組織中有少量表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞在游離端表達(dá)最深。
　　1.2 Western-blot檢測(cè)異位、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常內(nèi)膜組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　1.2.1 HIF-1a蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果顯示:HIF-

13、1a蛋白在各組表達(dá)由高到低的順序是:異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在位內(nèi)膜組與子宮肌瘤組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);子宮肌瘤組與正常內(nèi)膜組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　1.2.2 PHD2蛋白的表達(dá)
　　統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:PHD2蛋白在各組表達(dá)由高到低的

14、順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。
　　2、腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的建立
　　2.1 大鼠一般情況
　　實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)照組大鼠的毛色白且有光澤、精神佳、活潑、反應(yīng)靈敏，飲食、二便均正常。冷造冷組、冷造、造冷組大鼠出現(xiàn)身臟毛污，反應(yīng)遲鈍，蜷縮懶動(dòng)，后肢行動(dòng)遲緩、寒戰(zhàn)，扎堆怕冷、爪尾部蒼白，尾部皮下瘀紫、耳色蒼白，呼吸微弱，被毛無(wú)光澤，飲水量少，大便稀溏等。冷造冷組大鼠表現(xiàn)更為明顯。
　

15、　2.2 盆腔異位灶觀察肉眼見(jiàn)冷造冷組移植物生長(zhǎng)良好，體積明顯增大，呈隆起暗紅色或透亮的小囊狀，內(nèi)部充滿積液，表面血管清晰可見(jiàn)，異位組織周圍血管豐富，有些異位組織與周圍組織粘連;冷造及造冷組移植物體積較小，表面血管細(xì)，異位組織周圍血流差。
　　3、補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1 a、PHD2、VHL表達(dá)的影響
　　3.1 大鼠一般情況
　　對(duì)照組大鼠毛色白有光澤，精神佳，活潑，喜動(dòng)，反應(yīng)靈

16、敏，飲食大便正常。假手術(shù)組大鼠較對(duì)照組大鼠毛色稍暗，精神可，較活潑，喜動(dòng)，反應(yīng)較靈敏，飲食大便正常。
　　3.2 異位灶形態(tài)學(xué)觀察
　　中藥組、西藥組、模型組均見(jiàn)移植物生長(zhǎng)良好，體積明顯增大，呈隆起暗紅色或透亮的小囊狀，內(nèi)部充滿積液，表面血管清晰可見(jiàn)，異位組織周圍血管豐富，有些異位組織與腹腔臟器粘連。
　　結(jié)論:
　　1、臨床研究表明，HIF-1a在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位組織中表達(dá)增強(qiáng)，PHD2、VHL蛋白在子

17、宮異位內(nèi)膜組織中表達(dá)降低，證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)。通過(guò)相關(guān)性研究表明，HIF-1a與PHD2、VHL均呈負(fù)相關(guān)，表明在乏氧條件下，PHD2不被活化，VHL不能識(shí)別HIF-1a亞基，致HIF-1a的表達(dá)增強(qiáng)，提示HIF-1a、PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。
　　2、從大鼠的一般情況、盆腔異位病灶觀察、血清孕酮、睪酮、雌二醇、血流變等指標(biāo)及大鼠體溫、體重等情況進(jìn)行評(píng)估，“冷凍1個(gè)月-行子宮內(nèi)膜異位癥造

18、模-再冷凍1個(gè)月”的“冷造冷組”實(shí)驗(yàn)大鼠模型最符合腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥臨床特征?？勺鳛槟I陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥的動(dòng)物模型。
　　3、補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方可以降低腎陽(yáng)虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位灶中HIF-1a的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜異位癥的乏氧狀態(tài)，使脯氨酸羥化酶PHD2的活性增強(qiáng)，進(jìn)一步介導(dǎo)HIF-1a的降解;同時(shí)VHL與HIF-1a亞基結(jié)合而使后者蛋白化而被降解，從而使HIF-1a的表達(dá)降低，PHD2、VHL的表達(dá)升高，起