ABCG2、HiF-2a在乳腺癌中的表達(dá)及其與多藥耐藥關(guān)系的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　在世界范圍內(nèi)，乳腺癌已是目前女性最常見的惡性腫瘤。在我國(guó)，乳腺癌近10年的發(fā)病率增加了30％。因此如何準(zhǔn)確判斷乳腺癌患者預(yù)后，以及如何選擇合理有效的治療成為目前乳腺癌研究的重點(diǎn)。
　　目前，大家公認(rèn)的與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)包括病人年齡、腫瘤組織學(xué)類型、組織學(xué)級(jí)別、腫瘤大小、腫瘤細(xì)胞增殖活性(ki67)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、雌孕激素受體(ER、PR)以及酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體2(Her-2，或C-erbB

2、-2)的表達(dá)水平等臨床病理學(xué)指標(biāo)。在治療方面，手術(shù)切除腫瘤仍是乳腺癌治療的主要方法，此外，很多病人還接受術(shù)后輔助治療，以期減少局部及遠(yuǎn)處腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。為了得到最佳的治療效果，減少治療的毒副作用，輔助治療可選擇化療、放療、內(nèi)分泌及靶向治療等?；熢谌橄侔┲委熤衅鹬匾饔?，但研究表明，約90％的乳腺癌患者化療失敗歸咎于多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，因此MDR成為困擾乳腺癌治療的難題之一。MDR由多種因素誘導(dǎo)

3、，在一些耐藥相關(guān)蛋白的作用下將藥物從腫瘤細(xì)胞中泵出，腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，導(dǎo)致藥物毒性下降，這些耐藥相關(guān)蛋白都是膜蛋白，均屬于ATP結(jié)合的盒式(ATP bindingcassette，ABC)運(yùn)輸?shù)鞍准易濉?br>　　缺氧是實(shí)體腫瘤進(jìn)展的重要因素，而且與腫瘤細(xì)胞代謝、血管生成和轉(zhuǎn)移的多個(gè)指標(biāo)都密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)廣范缺氧的存在使放療或化療后生存率降低，而且缺氧與有很多腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。組織對(duì)缺氧的反應(yīng)主要是通過缺氧誘導(dǎo)因子

4、(Hypoxia-Inducible Factor，Hif)，Hif-1a和Hif-2a來介導(dǎo)的。盡管這兩種蛋白高度同源，但他們有不同的調(diào)控靶基因，并對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起不同的作用。Karolina等研究發(fā)現(xiàn)Hif-2a與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，但沒有發(fā)現(xiàn)Hif-1a有這種關(guān)系。
　　ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member2，或breast cancerresistance prote

5、in，BCRP)，是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中的成員之一，是一種重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在多藥耐藥方面有著不可忽視的地位。目前對(duì)ABCG2結(jié)構(gòu)、功能及其在多藥耐藥中的作用均進(jìn)行了大量研究。研究表明，ABCG2啟動(dòng)子有兩個(gè)功能區(qū)，分別是雌激素反應(yīng)元件（estrogen response elements，ERE）及缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response elements，HRE）。啟動(dòng)子通過激活A(yù)BCG2基因上游的PPARg(peroxi

6、some proliferator-activated receptor g)反應(yīng)元件來控制ABCG2的表達(dá)。
　　目前關(guān)于ABCG2及Hif-2a蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與前述乳腺癌相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性的研究還未見報(bào)道。而ABCG2啟動(dòng)子有雌激素反應(yīng)元件和缺氧反應(yīng)元件兩個(gè)功能區(qū)，提示我們ABCG2可能與ER等乳腺癌臨床病理指標(biāo)及Hif-2a等缺氧誘導(dǎo)因子存在相關(guān)性或調(diào)控關(guān)系。故我們?cè)谶@些方面進(jìn)行研究。
　　在本研究

7、中，我們首先采用組織芯片及免疫組化技術(shù)，分別檢測(cè)196例人乳腺癌手術(shù)切除石蠟包埋標(biāo)本中ABCG2及Hif-2a的表達(dá)，并對(duì)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別分析ABCG2、Hif-2a的表達(dá)與前述乳腺癌臨床病理指標(biāo)（年齡、組織學(xué)類型、組織學(xué)級(jí)別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER、PR、HER2以及Ki67等）及其ABCG2與Hif-2a之間的相關(guān)性，探討ABCG2與啟動(dòng)子功能區(qū)相關(guān)的ER及Hif-2a蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其是否存在相關(guān)性。繼而

8、，根據(jù)相關(guān)性研究的結(jié)果，構(gòu)建能夠持續(xù)特異性沉默Hif-2a表達(dá)的重組質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a，同時(shí)以隨機(jī)干擾序列重組質(zhì)粒pSUPER-siN為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及T47D。應(yīng)用RT-PCR、Western Blot、MTT等技術(shù)方法檢測(cè)干擾Hif-2a后，ABCG2 mRNA、蛋白質(zhì)及細(xì)胞耐藥性的變化，探討Hif-2a與ABCG2之間可能的調(diào)控關(guān)系，并提出在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ABCG2可能是Hif-2α直接調(diào)節(jié)的

9、下游靶基因這一論斷。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、研究病例標(biāo)本及組織芯片的制作
　　選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科存檔的臨床病理資料完整的196例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌蠟塊，每例選取兩個(gè)典型部位制作成組織芯片。
　　2、免疫組化及相關(guān)性分析
　　采用免疫組織化學(xué)二步法（PV-9000法）檢測(cè)196例原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中ABCG2及Hif-2a的表達(dá)情況，并設(shè)定染色強(qiáng)弱的判定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析了ABCG2及Hif-2

10、a的表達(dá)與上述乳腺癌臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，以及ABCG2表達(dá)與Hif-2a表達(dá)的相關(guān)性。
　　3、構(gòu)建沉默Hif-2a表達(dá)的干擾質(zhì)粒
　　分別設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Hif-2a基因的雙鏈干擾RNA序列以及作為對(duì)照的非靶向性干擾序列，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體pSUPER-siHif-2a和pSUPER-siN。酶切及測(cè)序鑒定正確后，大量擴(kuò)增。
　　4、細(xì)胞系的檢測(cè):
　　應(yīng)

11、用RT-PCR、qRT-PCR、Western Blot等方法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及T47D中ABCG2及Hif-2a的mRNA水平及蛋白水平。
　　5、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:
　　構(gòu)建的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，通過RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Hif-2a mRNA和ABCG2 mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用Western blot檢測(cè)Hif-2a蛋白和ABCG2蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用MTT法

12、檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(IC50)的改變，評(píng)價(jià)干擾Hif-2a對(duì)細(xì)胞多藥耐藥性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果:
　　ABCG2免疫組化染色，著色部位為細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的腫瘤組織內(nèi)，ABCG2表達(dá)強(qiáng)弱不等分布不均。15例（占7.7％）為完全陰性，80例（占40.8％）為陽性+，77例（占38.2％）為陽性++，24例（占12.3％）為陽性+++。按照ABCG2表達(dá)高低的

13、計(jì)算方法，結(jié)合陽性腫瘤細(xì)胞的比率，196例病例中，73例（占37.2％）ABCG2高表達(dá)，97例（占49.5％）低表達(dá)，26例（占13.3％）為陰性。
　　Hif-2a免疫組化染色，著色部位在細(xì)胞核。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的腫瘤組織內(nèi)，Hif-2a表達(dá)強(qiáng)弱不等分布不均。12例（占6.12％）為完全陰性，78例（占39.80％）為陽性+，69例（占35.20％）為陽性++，37例（占18.88％）為陽性+++。按照Hif-2a表達(dá)高低的

14、計(jì)算方法，結(jié)合陽性腫瘤細(xì)胞的比率，196例病例中，57例（占29.08％）Hif-2a高表達(dá)，114例（占58.16％）低表達(dá)，25例（占12.76％）為陰性。
　　2、ABCG2及Hif-2a的表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，以及ABCG2表達(dá)與Hif-2a表達(dá)的相關(guān)性。
　　統(tǒng)計(jì)分析表明，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)與HER-2表達(dá)明顯正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期也有明顯相關(guān)性。ABCG2蛋白表達(dá)水

15、平與下列臨床病理學(xué)指標(biāo)未見明顯相關(guān)性:病人年齡、組織學(xué)亞型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、ER、PR、以及Ki67。
　　統(tǒng)計(jì)分析表明，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞中Hif-2a蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及Ki67水平均有明顯相關(guān)性。而且Hif-2a蛋白表達(dá)與ABCG2表達(dá)明顯正相關(guān)。Hif-2a蛋白表達(dá)水平與下列臨床病理學(xué)指標(biāo)未見明顯相關(guān)性:病人年齡、組織學(xué)亞型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER、PR、以及HER-2。
　　3、轉(zhuǎn)染干擾H

16、if-2a的質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a后相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　干擾Hif-2a的質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a轉(zhuǎn)染后，MCF-7/pSUPER-siHif-2a及T47D/pSUPER-siHif-2a細(xì)胞中，Hif-2a基因的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，證明干擾效果良好。而在干擾后細(xì)胞中ABCG2的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平也明顯減低，說明Hif-2a與ABCG2之間可能存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系。MTT法檢測(cè)細(xì)

17、胞對(duì)化療藥物的耐受性，發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的IC50明顯降低，相對(duì)耐藥指數(shù)顯著下降，耐藥性被不同程度逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　1、ABCG2表達(dá)于大多數(shù)(86.7％)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞中，其中40％的病例為高表達(dá)。而且ABCG2蛋白的表達(dá)與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有顯著相關(guān)性。提示ABCG2不僅是一種耐藥相關(guān)蛋白，而且可能是一種能夠預(yù)測(cè)乳腺癌生物學(xué)行為、臨床侵襲性，判斷預(yù)后及化療效果的新的標(biāo)記物。<

18、br>　　2、Hif-2α表達(dá)于大多數(shù)(87.24％)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞中，其中29.08％的病例為高表達(dá)。而且Hif-2α蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中ABCG2蛋白的表達(dá)以及組織學(xué)分級(jí)、Ki67表達(dá)均有明顯相關(guān)性。提示Hif-2α不僅是一種缺氧誘導(dǎo)因子，而且可能是一種能夠預(yù)測(cè)乳腺癌惡性生物學(xué)行為以及化療效果不良的新的標(biāo)記物。
　　3、在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)，ABCG2的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平隨著Hif-2α的改變而改變，與Cindy