胰島素抵抗及糖尿病大鼠心房肌細胞電生理學研究.pdf

1、目的：
　　目前糖尿病(DM)在全世界普遍流行，特別是在經(jīng)濟急速發(fā)展的我國，已然成為一個嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。最新的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)DM可能為心房纖顫(Af)的誘因，盡管研究結果缺乏嚴格的一致性。2011年Rachel R等人在前人研究的基礎上，收集數(shù)篇關于糖尿病與房顫關系的前瞻性隊列研究及病例對照研究進行了薈萃分析，研究得出了較為信服的結論:糖尿病是房顫發(fā)生的獨立危險因素。胰島素抵抗與糖尿病密切相關，其不僅表現(xiàn)為代謝紊

2、亂引起代謝綜合征，還可導致一系列心血管事件。有意思的是，一個隨訪長達10年的隊列研究表明，胰島素抵抗患者房顫的發(fā)生率并未增加.
　　現(xiàn)有研究表明，糖尿病發(fā)生時心肌細胞已經(jīng)發(fā)生了電生理重構，主要表現(xiàn)為動作電位形態(tài)改變，這些改變增加了致心律失常的易感性。離子通道改變是電重構的基礎，心肌細胞有眾多離子通道:快鈉通道（the fast Na+ current，INa）主要介導動作電位的觸發(fā);瞬時外向鉀電流（the transient ou

3、tward K+ current，Ito）主要負責動作電位的快速復極;L型-鈣通道(L-Type Ca2+ current，ICa-L)主要負責動作電位平臺期的內(nèi)向電流，而內(nèi)向整流鉀電流（inward rectifier K+ current，IK1）主要負責靜息電位的維持及復極晚期的調(diào)整。
　　既往的研究表明:糖尿病患者的心電圖具有較大的變異性及異質性，如P波延長、P波離散度增加等。上述異常提示糖尿病患者心房可能存在除極障礙，導

4、致沖動的產(chǎn)生或傳導異常。心電圖P波代表心房的除極波，既往的研究表明P波延長與左房擴大、左房功能及隨后房顫的發(fā)生密切相關。先前已有學者經(jīng)發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠心房傳導速度明顯降低。另外，糖尿病患者體表心電圖P波離散度增加獨立于缺血、高血壓及左室肥厚等因素。盡管如此，糖尿病P波延長的可能機制目前仍不清楚。我們推測糖尿病心肌病變中心房肌細胞可能存在離子通道重構，但具體哪些離子通道受到影響目前仍不清楚，這對于將來治療糖尿病合并房顫進行抗心律失常藥物

5、選擇時極關重要。另外，作為糖尿病早期階段，即“胰島素抵抗”狀態(tài)下心房肌電生理學的特點目前國內(nèi)外尚未見報道，在此我們一并研究。這有利于動態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展到2型糖尿病期間的離子流變化，明確發(fā)生電生理重構的時間段，從而建立一個較為全面的離子機制。
　　綜合上述研究現(xiàn)狀，本研究主要分三部分進行探討。首先，建立大鼠胰島素抵抗及糖尿病模型，探討糖尿病大鼠心房肌細胞急性分離的方法。其次，采用膜片鉗技術檢測糖尿病階段心房肌細胞INa及IK1

6、，并檢測糖尿病大鼠左房大小及纖維化程度。另外，分析心房縫隙連接蛋白Cx40及Cx43的表達及分布情況，探討糖尿病P波延長的可能機制。最后，采用膜片鉗技術檢測胰島素抵抗及糖尿病心房肌細胞的電生理學變化，并檢測相關離子通道蛋白的表達情況。通過上述的研究，我們有可能發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠P波延長的分子基礎，并可動態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展到糖尿病階段心房肌細胞電生學演變的特點。由于物種差異，Wistar大鼠的心肌細胞擁有大量的Ito，幾乎沒有Ik，因此我

7、們在研究其離子機制時集中在INa(Nav1.5)，Ito(Kv4.2、Kv4.3及Kv1.4)，IK1（Kir2.1），ICa-L(Cav1.2)這幾個通道。
　　方法：
　　一、糖尿病心房肌細胞急性分離方法的探討
　　健康雄性Wistar大鼠，高脂高糖飲食6周后小劑量STZ腹腔注射建立糖尿病模型。8周后檢測空腹血糖、空腹胰島素水平，計算“胰島素穩(wěn)態(tài)評價指數(shù)”。采用Langendorff灌流裝置及改良的灌流法提取心房肌

8、細胞，采用形態(tài)學及免疫熒光對心房肌細胞進行鑒定，采用膜片鉗技術記錄心房肌細胞動作電位。
　　二、糖尿病誘導P波延長機制的探討
　　健康雄性Wistar大鼠，高糖高脂飲食合并STZ腹腔注射建立糖尿病模型，8周后檢測空腹血糖、空腹胰島素水平，計算“胰島素穩(wěn)態(tài)評價指數(shù)”。最終共納入對照組15只，糖尿病組20只。大鼠心房肌細胞急性分離，膜片鉗技術檢測INa及IK1，模擬標準Ⅱ導聯(lián)記錄并分析P波時限，心臟二維超聲檢測左房舒張末前后徑(

9、LADd)。Western-blot檢測Cx40及Cx43蛋白表達情況，免疫熒光檢測Cx40及Cx43蛋白分布情況，Masson染色檢測心肌纖維化程度。探討糖尿病誘導P波延長的可能機制。
　　三、從胰島素抵抗發(fā)展至糖尿病心房肌細胞電生理學變化的研究
　　健康雄性Wistar大鼠，單純高糖高脂飲食建立胰島素抵抗模型，采用“高胰島素----正糖鉗夾技術”檢測胰島素抵抗存在。采用高糖高脂飲食合并STZ腹腔注射建立糖尿病模型。腹腔注

10、射STZ8周后檢測空腹血糖、空腹胰島素水平，計算“胰島素穩(wěn)態(tài)評價指數(shù)”。最終納入對照組15只、胰島素抵抗組15只及糖尿病組20只。糖尿病病程8周時，急性分離大鼠心房肌細胞，膜片鉗技術檢測INa、 IK1、Ito、 ICa-L及APD。采用western-blot檢測Nav1.5、Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4、Kir2.1及Cav1.2的蛋白表達情況，動態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展至糖尿病期間心房肌電生理重構的演變情況。
　　結果：

11、
　　1、高糖高脂飲食及小劑量STZ腹腔注射可建立穩(wěn)定的2型糖尿病模型。改良的灌流法可獲得梭形、耐鈣的心房肌細胞。免疫熒光結果顯示心房肌細胞Kv1.5離子通道蛋白陽性。膜片鉗檢測結果提示該方法提取的心房肌細胞能夠產(chǎn)生動作電位。
　　2、糖尿病誘導P波延長（19.95±0.41 vs.17.40±0.47 ms;P＜0.05），兩組間LADd無明顯差異(4.51±0.04mmvs.4.41±0.05 mm，P＞0.05).膜片

12、鉗結果顯示兩組間心房肌細胞INa及IK1最大電流密度無明顯差異。與對照組相比，糖尿病組Cx40表達明顯下調(diào)，而Cx43則無明顯變化。Cx40組織間分布稀疏，Cx43出現(xiàn)側面化分布。Masson染色顯示，糖尿病組心房肌纖維化程度較對照組明顯加重。
　　3、糖尿病心房肌細胞APD較對照組明顯延長，而胰島素抵抗心房肌細胞APD較對照組無明顯差異。三組間靜息電位、動作電位幅度均無明顯差異。三組間INa最大電流密度無明顯差異。胰島素抵抗組心

13、房肌細胞IK1于-150mv處電流密度較對照組及糖尿病組明顯增大。糖尿病組大鼠心房肌細胞Ito最大電流密度較對照組明顯降低，而胰島素抵抗組則無明顯變化。胰島素抵抗組ICa-L最大電流密度較對照組明顯降低，糖尿病組則進一步降低。相應的western-blot結果顯示，三組間Kir2.1、Nav1.5蛋白表達無明顯差異，糖尿病組Kv4.2、Kv4.3蛋白表達明顯下調(diào)，Kv1.4蛋白明顯上調(diào)，而胰島素抵抗組Kv4.2、Kv4.3及Kv1.4則

14、無明顯變化。胰島素抵抗組Cav1.2蛋白表達降低，而糖尿病組則進一步降低。
　　結論：
　　1、改良的灌流法適用于糖尿病大鼠心房肌細胞的急性分離，有助于糖尿病心房肌細胞的電生理研究
　　2、糖尿病P波延長可能與Cx40表達下調(diào)、Cx43側面化分布及纖維化程度加重有關，與心房大小無關
　　3、糖尿病早期，即胰島素抵抗階段即存在離子通道重構。糖尿病心房肌電生理重構較胰島素抵抗更為嚴重，主要表現(xiàn)為復極障礙，而除極基本不