二維和三維培養(yǎng)小鼠ADMSCs成心肌分化的效果比較.pdf

1、背景：
　　心肌細(xì)胞的再生能力有限，目前心臟組織工程為心臟疾病后心肌細(xì)胞的修復(fù)和再生帶來了新的治療策略。在可移植的種子細(xì)胞中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AdiposeMesenchymal Stem Cells，ADMSCs)因其來源廣泛、取材方便，倫理限制較少，已成為心肌組織工程理想的種子細(xì)胞之一。Atelocollagen膠原具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性，可被制成三維立體支架，用作組織填充物和細(xì)胞培養(yǎng)支架。目前尚不知道ADM

2、SCs是否可以在Atelocollagen支架上被培養(yǎng)成三維心肌。本研究試圖把誘導(dǎo)心肌化的ADMSCs種植在支架上，體外培養(yǎng)成立體心肌。
　　目的：
　　探討小鼠ADMSCs在二維和三維培養(yǎng)條件下，利用不同誘導(dǎo)方法，評(píng)價(jià)誘導(dǎo)成心肌分化的效果，以及判斷三維培養(yǎng)后的ADMSCs在心臟內(nèi)的存活情況，為心肌組織工程提供實(shí)驗(yàn)參考。
　　方法：
　　1.取小鼠腹股溝皮下脂肪組織，分離培養(yǎng)ADMSCs，傳至第3代后，用CD29

3、+、CD45-標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分選ADMSCs。
　　2.使用成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADMSCs，對(duì)成骨誘導(dǎo)組行茜素紅染色，對(duì)成脂誘導(dǎo)組進(jìn)行油紅O染色，檢測(cè)其多向分化潛能。
　　3.分別利用5-aza和將ADMSCs注射心肌組織內(nèi)，誘導(dǎo)ADMSCs定向心肌分化，用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心肌特異性標(biāo)記cTnT的表達(dá)情況。
　　4.用DAPI、PKH26、GFP分別標(biāo)記ADMSCs后種植在Atelocollagen膠原支架上進(jìn)

4、行三維培養(yǎng)，觀察計(jì)算不同方法的標(biāo)記率。
　　5.將ADMSCs種植于三維支架上分別經(jīng)5-aza和在大鼠心肌組織內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo)，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察支架上的ADMSCs向心肌分化的情況，用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心肌特異性標(biāo)記cTnT的表達(dá)。觀察Atelocollagen膠原支架在心肌內(nèi)降解時(shí)間，檢測(cè)支架內(nèi)ADMSCs縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)，分析移植的細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞是否發(fā)生功能聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)的小鼠ADM

5、SCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，CD29表達(dá)率為94％、而CD45陽性率僅為0.19％，符合目前國(guó)際上公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子特征，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.成脂誘導(dǎo)14天，成骨誘導(dǎo)21天后，ADMSCs可分化為脂肪樣細(xì)胞和骨樣細(xì)胞，顯示ADMSCs具有多向分化潛能。
　　3.5-aza和大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境均可使ADMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，但心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)分化效率明顯高于5-aza組，且具有時(shí)間

6、依賴性，體內(nèi)移植組1周分化效率(42.93±4.04)％大于5-aza組3周的效率（33.33±3.79）％，P＜0.05。
　　4.DAPI、PKH26、GFP三種方法標(biāo)記后的ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上生長(zhǎng)并增殖，標(biāo)記率分別為DAPI(92.7％)、PKH26(89.2％)、GFP(95％)。
　　5.3d時(shí)移植的支架內(nèi)可見極少量ADMSCs，大部分移植細(xì)胞遷移至支架外。7d時(shí)部分移植細(xì)胞cTnT

7、呈陽性，Cx43呈陰性，13d時(shí)支架完全降解。支架上的細(xì)胞在5-aza誘導(dǎo)和在體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)均能使ADMSCs向心肌方向分化。
　　結(jié)論：
　　(1)大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境對(duì)小鼠ADMSCs定向心肌分化誘導(dǎo)效率高于體外5-aza誘導(dǎo)。(2)ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上良好生長(zhǎng)并增殖，體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)和體內(nèi)心肌微環(huán)境誘導(dǎo)均能使ADMSCs分化為心肌細(xì)胞，但移植到心肌內(nèi)后，支架上細(xì)胞遷移至支架外，并部分分