轉(zhuǎn)天蠶素B及串聯(lián)高Met和Lys納豆芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建.pdf

1、抗菌肽是一種具有抗菌生物活性且多為小于10KD的分子多肽，可以直接通過誘導(dǎo)機體獲取。其在食品、醫(yī)藥中被廣為應(yīng)用，同時也被認定是一類環(huán)保型飼料添加劑。天蠶素B(Cecropin B)是一種具有熱穩(wěn)定性的成熟小肽，僅含35個氨基酸，在已獲得的眾多抗菌肽中抗性較強。它對細菌、真菌、病毒等有著顯著的抑制殺傷性。
　　蛋氨酸是植物性蛋白中廣為缺失的一種氨基酸，因而增添蛋氨酸于動物的日糧中不僅能夠提高植物性蛋白的利用率，還能有效降低飼養(yǎng)動物所

2、需飼料的成本。在飼料工業(yè)中，賴氨酸的需求量很大。飼料中添加的賴氨酸主要通過微生物發(fā)酵或化學合成的方法獲取?；瘜W合成賴氨酸的生產(chǎn)技術(shù)相對繁雜，副產(chǎn)物較多，不可直接用于添加，且價格昂貴。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸的生物效率明顯高于化學合成法，其中益生菌產(chǎn)生的賴氨酸更是綠色、無污染、安全且能夠直接用作添加劑。
　　益生菌是由一種或多種有益微生物及代謝物構(gòu)成的活菌制劑，人類或動物能直接使用和喂食。納豆芽孢桿菌隸屬于益生菌，是枯草芽抱桿菌的一個

3、亞種，已被納入我國農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級微生物添加劑。其作為飼料添加劑能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進仔豬生長、提高畜禽免疫能力和抗應(yīng)激能力等。
　　本實驗利用基因工程方法，獲取了天蠶素B基因(CB)、高蛋氨酸蛋白基因(zein)及高賴氨酸蛋白基因(Cflr)，同時利用融合PCR技術(shù)將zein、Cflr進行了串聯(lián)。將CB基因與串聯(lián)的zein-Cflr基因分別連接至枯草芽孢桿菌的一種表達載體pHT43，構(gòu)建出pHT43/CB和pHT43/z

4、ein-Cflr重組表達載體。之后，利用化學方法制備納豆芽孢桿菌感受態(tài)，將兩種重組載體分別轉(zhuǎn)化至納豆芽孢桿菌中，并驗證重組載體在目的菌中穩(wěn)定傳代，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定率均為100％。為了驗證此類重組載體對納豆芽孢桿菌自身的生長代謝是否有促進或抑制作用，測定了重組菌與野生菌的生長曲線，結(jié)果表明該質(zhì)粒幾乎對目的菌無影響。
　　對轉(zhuǎn)入pHT43/CB的納豆芽胞桿菌進行了抑菌活性的測定，抑制大腸桿菌的檢測中，發(fā)現(xiàn)于酪乳桿菌的抑菌活性優(yōu)于重組菌，枯草

5、芽孢桿菌和重組菌的抑菌活性均較低，但重組菌的抑菌活性優(yōu)于野生菌的抑菌活性;抑制金黃色葡萄球菌的檢測中，發(fā)現(xiàn)重組菌的抑菌活性明顯高于干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌及其野生菌。此外，還進行了Western-blot的驗證，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后有目的蛋白的表達。
　　對轉(zhuǎn)入pHT43/zein-Cflr的納豆芽胞桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進行了SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在40ku處出現(xiàn)了1條明顯條帶，該值與目的蛋白帶相符。此外，還通過HPLC檢測菌株發(fā)