大鼠肌肉挫傷后肌鈣蛋白Ⅰ mRNA表達(dá)與損傷時(shí)間關(guān)系的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠肌肉挫傷后骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ(skeletaltroponinⅠ，sTnI)mRNA表達(dá)，探尋其時(shí)序性表達(dá)規(guī)律，探討sTnImRNA表達(dá)變化應(yīng)用于損傷時(shí)間推斷的可行性，旨在為法醫(yī)學(xué)早期損傷時(shí)間的推斷提供科學(xué)依據(jù)。 方法：選取健康成年雄性SD大鼠63只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)、死后損傷組(9只)和生前損傷組(48只)。均實(shí)施麻醉、褪毛后，利用改進(jìn)的自由落體裝置，250g重力錘自150cm高

2、度垂直自由落下，造成大鼠右后肢大腿內(nèi)側(cè)肌群挫傷。損傷后0.5h、1h、6h、12h、18h、24h、30h、36h八個(gè)時(shí)間點(diǎn)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只)取挫傷處肌肉組織50mg，置于液氮中保存?zhèn)溆?；正常?duì)照組大鼠未打擊造傷；死后損傷組脫頸處死后，自由落體打擊同一部位，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。以膜吸附技術(shù)為基礎(chǔ)的SV Total RNA Isolation System提取肌肉組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，梯度濃度稀釋cDNA原液分別

3、制作sTnI和參比基因的相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；選取管家基因核糖體蛋白L32(RibosomalProteinL32，RPL32)為參比基因，利用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)sTnImRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的相對(duì)表達(dá)量，分別與損傷時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： (1)Agilent2100芯片生物分析儀和2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA純度、濃度及完整性較好，均可滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。 (2

4、)sTnI與參比基因RPL32擴(kuò)增效率分別為103.6％和100.5％，一致性較好，說明參比基因選擇正確；擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，說明引物設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)、反應(yīng)性能良好；sTnI基因融解溫度為88℃，RPL32基因融解溫度為84℃，兩者融解曲線均為單一峰型，基底窄而峰高，表明并無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。 (3)大鼠骨骼肌挫傷后sTnI mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，挫傷后0.5h、1h、6hsTnI mR

5、NA表達(dá)量分別為正常組的78.17％、41.58％、32.13％且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6h～36h sTnI mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (4)為了比較生前損傷組正常肌肉與損傷肌肉中sTnI mRNA的表達(dá)水平，選取挫傷后18h組大鼠左后肢同一部位取材。結(jié)果表明正常肌肉中sTnI mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比無差異(P＞0.05)，而同一個(gè)體損傷肌肉中sTnI mRNA表達(dá)與正常

6、肌肉中sTnI mRNA表達(dá)存在差異(P＜0.05)。 (5)與正常對(duì)照組相比，死后損傷組雙后肢sTnl mRNA的量約下降了30％(P＜0.05)，死后損傷組各時(shí)間點(diǎn)sTn ImRNA的量無差異(P＞0.05)。 結(jié)論： (1)生前損傷組正常肌肉中sTnI mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比無差異(P＞0.05)，而同一個(gè)體損傷肌肉中sTnI mRNA表達(dá)與正常肌肉中sTnI mRNA表達(dá)存在差異(P＜0.05)，s