大鼠肌肉挫傷后組織中時間相關基因表達的研究.pdf

1、目的: 運用差異顯示技術結(jié)合硝酸銀染色篩選大鼠肌肉挫傷后與正常肌肉表達差異的基因，并通過Real—timePCR方法研究差異基因與損傷時間的關系，旨在尋找一種或幾種與損傷相關的敏感基因，為法醫(yī)學損傷時間推斷提供科學、有效的指標。 方法: 1. 12只健康成年SD大鼠隨機分為實驗組和正常對照組。實驗組大鼠建立肌肉挫傷模型，損傷后4小時處死，提取100mg損傷處肌肉組織。對照組大鼠在規(guī)定時間內(nèi)處死，提取相同部位100mg肌肉

2、組織。兩組肌肉組織經(jīng)SV Total RNA Isolation system提取總RNA，并經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer進行質(zhì)量控制檢測，SIN值大于8.0的樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于下游實驗。 2．采用4種錨定引物和3種隨機引物共12種組合對實驗組和對照組樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后硝酸銀染色進行差異表達分析。采用煮沸法回收差異條帶，并進行二次擴增，擴增產(chǎn)物純化后與載體連接、克隆，進行

3、序列分析，將測序所得差異序列與GenBank進行同源性比較。 3.4只健康成年SD大鼠隨機分為正常對照組和損傷組，提取各組樣本的總RNA。在差異序列兩端設計特異性引物，采用SYBR()GreenⅠ染料法進行Real—timePCR擴增，通過分析擴增曲線及溶解曲線，鑒定差異表達基因的真?zhèn)巍?4.12只健康成年SD大鼠隨機分為正常對照組、損傷后6小時組和損傷后12小時組。采用Real—timePCR檢測正常肌肉組織、損傷后6

4、小時肌肉組織和損傷后12小時肌肉組織中β—Actin等九種常用內(nèi)參基因的表達水平，通過Normfinder、geNorm和BestKeeper三種軟件分析九種常用內(nèi)參基因在肌肉組織損傷后表達的穩(wěn)定性，尋找合適的內(nèi)參基因。 5.54只健康成年SD大鼠隨機分為正常對照組和損傷組，建立不同損傷時間大鼠肌肉挫傷模型，提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄后采用差異基因的上下游特異性引物進行Real—timePCR擴增，分析差異基因與損傷時間的關系。

5、 結(jié)果: 1．采用Progema公司的SV Total RNA Isolation System提取的總RNA具有較高的RIN值，且沒有DNA及蛋白質(zhì)的污染。各樣本RIN值在8.3～8.8之間，均大于8.0。每個樣本都可見清晰的18s及28s峰，在18s峰之前基線平坦，沒有降解的RNA片段出現(xiàn)。28s峰之后，基線也比較平直，說明沒有基因組DNA及蛋白質(zhì)的污染，可以保證后續(xù)驗證實驗的準確性。 2．經(jīng)過對21條感興趣的差異

6、條帶進行回收及再擴增，共有12條差異條帶得到成功回收。DNA重組、轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選重組成功的載體，經(jīng)序列分析有5條差異條帶片段較長，其他條帶片段較短，多數(shù)為引物二聚體序列。 3．經(jīng)過與GenBank進行同源性比較及Real—timePRC鑒定，5條差異性片段均從總RNA中得到了有效擴增，且溶解曲線均為單一峰型，說明均為陽性差異片段。其中3條為已知基因，與sTnI、Mx2及Cox6c匹配度較高，另外兩條可能為新基因，有待于進一步研

7、究。 4．通過Real—timePCR的方法測定損傷后不同時間點肌肉組織中常用內(nèi)參基因的CT值，經(jīng)geNorm、Normfinder及BestKeeper軟件分析，得出RPL13和RPL32在肌肉組織損傷后表達相對穩(wěn)定，可以作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M行均一化處理。而常用的β—Actin及GAPDH在不同損傷時間肌肉組織中表達不穩(wěn)定。 5、經(jīng)Real—timePCR分析，sTnI mRNA在損傷后表達逐漸降低，在0.5h、1

8、h、6h sTnImRNA表達量分別為正常組的78.17％、41.58％、32.13％，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，6h～36h sTnI mRNA表達量與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Mx2 mRNA在損傷后0.5小時表達驟然升高達到正常對照組的84.3倍，隨著損傷時間的延長，其表達量逐漸下降，損傷后18小時降低到正常對照組的0.65倍，在損傷后24小時又出現(xiàn)一個表達高峰，達正常對照組的37.1倍，隨后又逐漸下降。

9、Frag-3 mRNA在損傷早期隨著時間延長表達量逐漸增高，損傷后6小時其表達量高達正常對照組的243.5倍，損傷后12小時恢復到接近正常表達量水平，損傷后18小時，又出現(xiàn)一個小的表達高峰，為正常對照組的11.38倍，隨后又下降至正常組水平。肌肉挫傷后Cox6c mRNA表達量的變化幅度較小，在正常組表達量的0.24～1.57倍之間。損傷后0.5小時，Cox6c mRNA表達量最高，為正常對照組的1.57倍。隨著損傷時間的延長，其表達量

10、逐漸減少，在1小時和6小時分別為正常對照組的1.29倍和1.19倍。損傷后18小時，其表達量已降至正常組水平以下，30小時表達量最低，為正常對照組的0.24倍。Frag-5 mRNA在肌肉損傷后36小時內(nèi)均呈現(xiàn)相對高表達的狀態(tài)。損傷的初始階段其表達量迅速升高，0.5小時達到正常對照組的5.7倍，1小時達到一個高峰，為正常對照組的6.19倍。隨后開始下降，12小時達到最低表達量，為正常對照組的1.2倍。在18小時達到又一個高峰，為正常對照