大鼠局灶性腦挫傷后Homer蛋白表達(dá)變化.pdf

1、腦是人體的生命中樞，是最易受損的器官。腦損傷在法醫(yī)鑒定工作中很常見，且隨著經(jīng)濟(jì)和交通的迅速發(fā)展，創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生率逐年升高，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人們的生命健康。因此關(guān)于腦損傷時(shí)間、機(jī)制、損傷程度的研究就顯得非常重要。Homer蛋白是突觸后密度蛋白家族成員之一，它是聯(lián)系突觸內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白、信號(hào)蛋白的重要物質(zhì)。最初在神經(jīng)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，它在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸形成、受體轉(zhuǎn)運(yùn)和受體細(xì)胞內(nèi)定位起重要作用。癲癇、高頻刺激、損傷及發(fā)育等興奮性突觸活動(dòng)可誘導(dǎo)Hom

2、er蛋白表達(dá)增加。目前為止，顱腦損傷機(jī)制方面的研究很多，其中機(jī)制之一是通過代謝性谷氨酸受體（mGluRs）引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放導(dǎo)致神經(jīng)元損傷；有研究發(fā)現(xiàn)，Homer蛋白在代謝性谷氨酸受體引起的神經(jīng)元損傷中起到重要作用；另有研究發(fā)現(xiàn)，在彌漫性顱腦損傷動(dòng)物模型中Homer蛋白表達(dá)增加，因此有必要利用腦損傷模型，進(jìn)一步觀察Homer蛋白表達(dá)變化規(guī)律，完善Homer蛋白在各種腦損傷模型中的研究，為腦損傷時(shí)間推斷法醫(yī)鑒定提供參考依據(jù)。
　　

3、 材料與方法：
　　 一、動(dòng)物模型的制作，分組與對(duì)照
　　 雄性Wistar大鼠50只，體重220-250g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。隨機(jī)分為10組，其中包括8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)正常對(duì)照組，1個(gè)假手術(shù)組，每組5只大鼠。實(shí)驗(yàn)組采用吳旭等[3]研制的大鼠腦挫傷模型制作方法，制造大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型。乙醚吸入預(yù)麻醉，大鼠稱重后，2％戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm，矢狀

4、縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好，采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織；假手術(shù)組以相同的方法鉆孔，但不進(jìn)行打擊。術(shù)后動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后0.5、3、6、12h和1、3、5、7d將大鼠乙醚麻醉后脫頸椎處死。手術(shù)取出腦組織，沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分，并對(duì)損傷周邊區(qū)進(jìn)行取材、修塊，一份用于免疫組化染色，另一份用于Western blot檢測(cè)。對(duì)照組和假手術(shù)組

5、以同樣方法取相同部位的腦組織作為對(duì)照。
　　 二、免疫組織化學(xué)染色
　　 腦組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法（SP法）進(jìn)行免疫組化染色，并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟同試劑盒說明書。Homer單克隆一抗（1:200）稀釋，4℃孵育過夜。染色過程中另以一抗稀釋液替代一抗，作為陰性對(duì)照。小鼠來源Homer（D-3）單克隆抗體購自Santa Cruz

6、Biotechnology，小鼠SP免疫組織化學(xué)試劑盒（SP-9002）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　 三、Western blot檢測(cè)
　　 對(duì)用于Western blot的腦組織進(jìn)行裂解、勻漿、離心，提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)印，5％脫脂牛奶封閉，一抗（1:800稀釋）、二抗（1:5000稀釋）孵育后，DAB顯色。實(shí)驗(yàn)中以GADPH為內(nèi)參。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

7、一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　 對(duì)照組及假手術(shù)組神經(jīng)元胞漿中可見少量Homer蛋白表達(dá)，陽性染色較淡。實(shí)驗(yàn)組中，腦挫傷后0.5h、3h組挫傷周邊區(qū)可見陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，胞漿內(nèi)Homer蛋白表達(dá)增多，陽性染色較深；6h、12h、1d組陽性細(xì)胞數(shù)維持在較高水平，傷后12h組陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，隨后3d組可見陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降，5d、7d組基本降至基礎(chǔ)水平，并可見陽性細(xì)胞染色較淡。
　　 二、Western blot結(jié)果

8、r>　　 對(duì)照組及假手術(shù)組可見少量Homer蛋白表達(dá)；腦挫傷后0.5h、3h組可見Homer蛋白表達(dá)增加，6h、12h、1d組Homer蛋白表達(dá)維持較高水平。12h組達(dá)到高峰，隨后3d組下降，5d、7d組降至基礎(chǔ)水平。取損傷后不同時(shí)間段條帶的平均光密度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法