Bt Cry2Aa毒素基因工程抗體的制備及活性研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)以生物制劑或轉(zhuǎn)基因植物的形式被廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)的生物防治，其在帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益的同時(shí)，也存在著生態(tài)安全隱患，因此轉(zhuǎn)Bt基因產(chǎn)品的檢測(cè)監(jiān)控技術(shù)是其產(chǎn)品安全管理、市場(chǎng)監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的技術(shù)基礎(chǔ)和必要保障。
　　目前檢測(cè)技術(shù)正隨著基因工程抗體的不斷發(fā)展而改革創(chuàng)新。新型抗體-十二肽和單鏈抗體(single-chain antibody fragment，scF

2、vs)已逐漸應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。十二肽是將隨機(jī)十二肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上，所展示的十二肽表達(dá)在pⅢ的N末端，目前主要應(yīng)用于模擬抗原表位;單鏈抗體(ScFv)是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)由氨基酸linker拼接而成，分子量約為30 kD。這些新型抗體可以保持與抗原結(jié)合的特異性并且無(wú)需免疫手段，通過(guò)原核表達(dá)大量制備。噬菌體展示技術(shù)正是篩選、制備和表達(dá)單鏈抗體的一種最有效方式，而且也是獲得抗獨(dú)特型抗體的一種新

3、的制備方式。利用噬菌體展示技術(shù)將抗體的基因型和表現(xiàn)型相結(jié)合的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步開(kāi)展親和力成熟及蛋白結(jié)合機(jī)制等研究提供了基礎(chǔ)。以此為基礎(chǔ)，本文開(kāi)展了以下三個(gè)方面的內(nèi)容:
　　1.建立基于十二肽檢測(cè)Cry2Aa毒蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法
　　利用噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)對(duì)Cry2Aa毒素蛋白進(jìn)行四輪篩選，并從第4輪產(chǎn)物中隨機(jī)挑選了20個(gè)克隆，通過(guò)單克隆ELISA法鑒定出這些克隆均能與Cry2Aa毒素特異性結(jié)合。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)

4、增、DNA電泳鑒定及測(cè)序，推導(dǎo)出8條不同的序列。挑取陽(yáng)性值最高的克隆GT（氨基酸序列為GTPWHHHRHLIV），由此建立了基于十二肽的Cry2Aa毒蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。該方法的抑制中濃度(IC50)為1.139μg/mL，最低檢測(cè)限IC10為0.0211μg/mL，線性檢測(cè)范圍為0.0478～22.691μg/mL（y=23.091gx十48.692，R2=0.9963）。噬菌體展示肽庫(kù)篩選方法為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)Cry2

5、Aa毒蛋白提供了新的途徑。
　　2.建立基于單鏈抗體檢測(cè)Cry2Aa毒蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法
　　通過(guò)優(yōu)化固相化篩選策略，利用人源化噬菌體抗體庫(kù)(TomlinsonⅠ)篩選抗Cry2Aa毒蛋白的單鏈抗體(Single-chain antibodies，scFv)。經(jīng)4輪“擴(kuò)增-吸附-洗脫”后，從最后一輪洗脫產(chǎn)物中隨機(jī)挑取200個(gè)單菌落進(jìn)行單克隆ELISA鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增、DNA電泳鑒定及測(cè)序，成功篩選

6、獲得12個(gè)陽(yáng)性噬菌體scFvs，經(jīng)鑒定均有完整外源基因片段插入。將相對(duì)結(jié)合活性最好的陽(yáng)性克隆scFv-A3替換到宿主菌HB2151中進(jìn)行可溶性誘導(dǎo)表達(dá)并純化。并利用純化后的scFv-A3作為“捕獲抗體”，Anti-Cry2Aa兔多克降抗體作為“檢測(cè)抗體”，建立針對(duì)Cry2Aa的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法的最低檢測(cè)限為1.08 ng/mL線性檢測(cè)范圍在7.1 ng/mL-3.8μg/mL，線性回歸方程為y=167.96x

7、+0.4513(R2=0.9909)。
　　3.Cry2Aa毒蛋白的抗獨(dú)特型單鏈抗體的篩選
　　以Cry2Aa為免疫原免疫新西蘭大白兔得到Cry2Aa的多克隆抗體。再以親和純化Cry2Aa多抗和陰性抗體作為包被原，通過(guò)扣除篩選（subtractive panning）策略在人源化噬菌體抗體庫(kù)TomlinsonⅠ中，淘選Cry2Aa毒蛋白的抗獨(dú)特型單鏈抗體。分別采取兩種試驗(yàn)方案:一種是只進(jìn)行一輪篩選，洗滌次數(shù)為40次;另一種是

8、進(jìn)行四輪篩選，逐級(jí)降低包被原，增加洗脫次數(shù)，具體方法同抗Cry2Aa單鏈抗體的篩選方法。兩種方法均挑取200個(gè)克隆。結(jié)果顯示:只經(jīng)過(guò)一輪篩選，可獲得并鑒定出38個(gè)陽(yáng)性克隆;經(jīng)過(guò)四輪篩選之后獲得125個(gè)陽(yáng)性克隆。再通過(guò)與受體（小菜蛾的BBMV）結(jié)合后，其中B10的OD450為0.806最高，F(xiàn)2為0.584次之，陽(yáng)性對(duì)照1.472，陰性對(duì)照0.138，無(wú)關(guān)克隆反應(yīng)值0.105。說(shuō)明B10和F2均與小菜蛾的BBMV有一定的結(jié)合活性，確定這2