Bt Cry1類毒素廣譜噬菌體抗體的篩選與鑒定.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bt)作為目前應用最廣泛的微生物殺蟲劑，由于具有對環(huán)境友好，對人畜無害，殺蟲譜廣等優(yōu)勢，在生物殺蟲劑及轉基因材料研究中一直備受關注。隨著轉Bt Cry基因在抗蟲性作物中大面積的推廣及應用，在給人類帶來極其顯著的經濟、社會和生態(tài)效益的同時，其應用存在的生態(tài)安全風險以及對人類和其它非靶標生物的安全隱患也備受關注，越來越多的國家針對轉基因產品建立了標識系統(tǒng)，因此對轉Cry基因作物中毒素表達產物的安全篩查檢測就尤顯迫切。目前報道

2、對轉基因產品中毒素蛋白的檢測方法和市場應用的ELISA試劑盒主要是單一毒素的抗體檢測，難以滿足實際應用時一種抗體檢測多種毒素的需求。因此，憑借Bt Cry毒素三維結構具有較高相似性的特點，開發(fā)基于共性結構的Bt Cry毒素廣譜特異性檢測技術是一項非常有應用價值的工作。
　　本研究以5種Cry1類毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F)為對象，分析定位共性結構域，表達并純化獲得共性結構域蛋白，用于制備針

3、對Bt Cry1類毒素的廣譜特異性抗體，應用于Bt毒素的檢測，以期為Bt制劑及轉基因Bt Cry毒素蛋白的殘留檢測奠定基礎。主要結果包括以下幾方面:
　　1、分析并定位五種Cry1類毒素的共性結構域
　　運用生物信息學軟件和網絡數(shù)據(jù)庫資源，首先對5種Cry1類毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F)的氨基酸序列進行比對分析，然后采取同源建模的方法分別預測了這五種Cry1類毒素的DomainⅠ三維

4、結構模型并分析了相關的生物學功能。結果發(fā)現(xiàn)，五種Cry1類毒素的三個結構域的氨基酸序列比對，其中DomainⅠ的序列一致性最高達到71％，而且在三維結構上具有高度的相似性，DomainⅠ幾乎完全重合，構建的模型經Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D模型評價軟件檢驗均具有合理性。綜合分析結果，確定5種Cry1類毒素的DomainⅠ區(qū)域為共性結構域。
　　2、共性結構域蛋白的原核表達、純化及生物學鑒定

5、>　　通過采用基因工程技術，設計引物并擴增DomainⅠ基因，構建pET26b-DomainⅠ的原核表達載體，重組質粒經酶切鑒定、序列比對驗證正確后，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達共性結構域蛋白，并對其表達產物進行純化、鑒定。結果原核表達、純化獲得共性結構域蛋白，經抗原性分析結合ELISA試驗驗證其具備很好的免疫原性和免疫反應性，為下一步利用共性結構域為靶標分子制備廣譜特異性識別Cry1類抗體奠定基礎。
　　3

6、、Bt Cry1類毒素廣譜噬菌體抗體的篩選、鑒定及活性分析
　　以純化的共性結構域蛋白作為篩選分子，利用噬菌體展示技術通過扣除篩選(subtractive panning)策略從人源噬菌體單域抗體庫(DAb庫)中篩選具有廣譜特異性的單域抗體并獲得其基因序列。結果顯示:經過4輪篩選后，通過單克隆ELISA方法和PCR鑒定出9個陽性克隆，經DNA測序和氨基酸序列比對，最終得到5株不同氨基酸序列的陽性克隆，其中E3對5種Cry1類毒素蛋