Bt Cry1類毒素廣譜噬菌體抗體的篩選與鑒定.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bt)作為目前應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑，由于具有對環(huán)境友好，對人畜無害，殺蟲譜廣等優(yōu)勢，在生物殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因材料研究中一直備受關(guān)注。隨著轉(zhuǎn)Bt Cry基因在抗蟲性作物中大面積的推廣及應(yīng)用，在給人類帶來極其顯著的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益的同時，其應(yīng)用存在的生態(tài)安全風(fēng)險以及對人類和其它非靶標生物的安全隱患也備受關(guān)注，越來越多的國家針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品建立了標識系統(tǒng)，因此對轉(zhuǎn)Cry基因作物中毒素表達產(chǎn)物的安全篩查檢測就尤顯迫切。目前報道

2、對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中毒素蛋白的檢測方法和市場應(yīng)用的ELISA試劑盒主要是單一毒素的抗體檢測，難以滿足實際應(yīng)用時一種抗體檢測多種毒素的需求。因此，憑借Bt Cry毒素三維結(jié)構(gòu)具有較高相似性的特點，開發(fā)基于共性結(jié)構(gòu)的Bt Cry毒素廣譜特異性檢測技術(shù)是一項非常有應(yīng)用價值的工作。
　　本研究以5種Cry1類毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F)為對象，分析定位共性結(jié)構(gòu)域，表達并純化獲得共性結(jié)構(gòu)域蛋白，用于制備針

3、對Bt Cry1類毒素的廣譜特異性抗體，應(yīng)用于Bt毒素的檢測，以期為Bt制劑及轉(zhuǎn)基因Bt Cry毒素蛋白的殘留檢測奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果包括以下幾方面:
　　1、分析并定位五種Cry1類毒素的共性結(jié)構(gòu)域
　　運用生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源，首先對5種Cry1類毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F)的氨基酸序列進行比對分析，然后采取同源建模的方法分別預(yù)測了這五種Cry1類毒素的DomainⅠ三維

4、結(jié)構(gòu)模型并分析了相關(guān)的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五種Cry1類毒素的三個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對，其中DomainⅠ的序列一致性最高達到71％，而且在三維結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，DomainⅠ幾乎完全重合，構(gòu)建的模型經(jīng)Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D模型評價軟件檢驗均具有合理性。綜合分析結(jié)果，確定5種Cry1類毒素的DomainⅠ區(qū)域為共性結(jié)構(gòu)域。
　　2、共性結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達、純化及生物學(xué)鑒定

5、>　　通過采用基因工程技術(shù)，設(shè)計引物并擴增DomainⅠ基因，構(gòu)建pET26b-DomainⅠ的原核表達載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、序列比對驗證正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達共性結(jié)構(gòu)域蛋白，并對其表達產(chǎn)物進行純化、鑒定。結(jié)果原核表達、純化獲得共性結(jié)構(gòu)域蛋白，經(jīng)抗原性分析結(jié)合ELISA試驗驗證其具備很好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，為下一步利用共性結(jié)構(gòu)域為靶標分子制備廣譜特異性識別Cry1類抗體奠定基礎(chǔ)。
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6、、Bt Cry1類毒素廣譜噬菌體抗體的篩選、鑒定及活性分析
　　以純化的共性結(jié)構(gòu)域蛋白作為篩選分子，利用噬菌體展示技術(shù)通過扣除篩選(subtractive panning)策略從人源噬菌體單域抗體庫(DAb庫)中篩選具有廣譜特異性的單域抗體并獲得其基因序列。結(jié)果顯示:經(jīng)過4輪篩選后，通過單克隆ELISA方法和PCR鑒定出9個陽性克隆，經(jīng)DNA測序和氨基酸序列比對，最終得到5株不同氨基酸序列的陽性克隆，其中E3對5種Cry1類毒素蛋