假單胞菌M18應答調控基因ppbR的克隆及功能研究.pdf

1、革蘭氏陰性細菌存在著與菌群傳感（Quorum Sensing）相關聯(lián)的雙元調控系統(tǒng)（two-component regulatory system），雙元系統(tǒng)參與調控細菌多種生命活動。根據(jù)銅綠假單胞菌基因組序列分析表明，銅綠假單胞菌中有64個應答調控子基因和63個組氨酸激酶基因，然而許多雙元調控系統(tǒng)的生物功能仍然未知，目前只有少數(shù)例如GacA-GacS、PprA-PprB等雙元系統(tǒng)有相關生物功能的文獻報道，在假單胞菌中，GacA-Gac

2、S、PprA-PprB這兩個調控系統(tǒng)參與調控菌群傳感關聯(lián)基因的表達和信號分子合成等細菌的生命活動。 PA2572基因位于銅綠假單胞菌PAO1全基因組上，是根據(jù)其保守氨基酸基序、結構特征或者與其它已知功能的基因具有一定同源性而推測出其功能的基因，屬于Ⅲ類基因(class3)，根據(jù)推測，PA2572編碼蛋白可能是一個雙元調控系統(tǒng)的應答調節(jié)子，通過蛋白比對結果表明PA2572編碼蛋白是一個含有 REC(CheY-like)結構域和H

3、D-GYP 結構域的應答調節(jié)子，并推測與細菌的運動力、次生代謝產(chǎn)物合成、蛋白質分泌以及與菌群傳感(Quorum Sensing)系統(tǒng)相關聯(lián)。但是所有這些功能只是通過同源性分析推測，并沒有得到實驗驗證及相關報道。 假單胞菌M18( Pseudomonas sp. M18) 是從甜瓜根際土壤中分離到的促進植物生長的根際細菌，迄今為止的文獻報道中唯一能同時分泌藤黃綠菌素(Pyoluteorin, Plt)和吩嗪-1-羧酸(Phena

4、zine-1-carboxylic acid，PCA) 兩種抗生素的假單胞菌株，通過菌種鑒定，假單胞菌M18和銅綠假單胞菌PAO1的相似性比較高。為了進一步通過實驗研究PA2572基因的同源基因在假單胞菌M18中的功能，本研究從M18基因組DNA中克隆出PA2572基因的同源基因ppbR，序列分析表明M18的ppbR基因序列與銅綠假單胞菌PAO1的PA2572基因序列同源程度為99.63％。構建了基因ppbR突變株M18P，通過對野生株

5、和突變株在泳動能力、群集運動能力、PCA和Plt生物合成的動力學分析、菌群傳感系統(tǒng)信號分子產(chǎn)量變化等相關研究，初步確認了ppbR基因在假單胞菌M18中的功能作用。研究結果表明，突變株M18P在在泳動能力和群集運動能力上有顯著的下降。在KMB和PPM培養(yǎng)基中，突變株合成PCA的能力比野生型有顯著的下降。特別是在PPM發(fā)酵液中PCA積累量僅為野生型的50％。在KMB培養(yǎng)基中，突變株Plt的積累量和野生型沒有顯著的差異。在PPM和KMB培養(yǎng)基