海洋假單胞菌來(lái)源的新型海藻糖合成酶的基因克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原二糖廣泛存在于多種生物體內(nèi)。由于其性質(zhì)特殊，海藻糖在生物醫(yī)藥、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，但其市場(chǎng)應(yīng)用由于生產(chǎn)成本過(guò)高而受到限制。目前在生物體內(nèi)已經(jīng)鑒定了至少5條海藻糖合成酶途徑。在這5條途徑中，海藻糖合成酶(trehalose synthase，TreS)途徑是以低成本的麥芽糖為底物，通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用一步法生成海藻糖，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
　　 海洋是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)大環(huán)境，具有高鹽、高壓、低溫

2、、缺氧等一系列復(fù)雜的特點(diǎn)，來(lái)源于海洋微生物的酶通常具有一些特殊的酶學(xué)性質(zhì)。此外，海藻糖能夠在極端環(huán)境下對(duì)微生物產(chǎn)生保護(hù)作用，海洋微生物為了能在海洋中生存需要產(chǎn)生較多的海藻糖來(lái)對(duì)抗環(huán)境壓力。因此，從海洋微生物中篩選具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的新型TreS是一個(gè)非常有用的途徑。
　　 目前，雖然已有多篇來(lái)源于不同物種的TreS的克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究的文獻(xiàn)報(bào)道，但還沒(méi)有一個(gè)關(guān)于海洋微生物來(lái)源的TreS的相關(guān)報(bào)道。在本研究中，通過(guò)篩選本課題組

3、的海洋微生物菌株庫(kù)，我們獲取了一個(gè)新型的海洋微生物來(lái)源的tres基因。我們將該tres基因在大腸桿菌中重組表達(dá)并將重組蛋白純化。此外，我們對(duì)該酶可能參與底物結(jié)合或催化的重要?dú)埢M(jìn)行了鑒定，并對(duì)該酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能的機(jī)制也進(jìn)行了探討。
　　 第一部分:新型tres基因的獲取、克隆、表達(dá)及純化
　　 首先，從171株海洋微生物菌株中我們篩選到一個(gè)TreS高產(chǎn)菌株P(guān)8005。通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物與PCR擴(kuò)增，我

4、們獲得了一長(zhǎng)648 bp的核心序列。隨后，通過(guò)TAIL-PCR，我們獲取了一個(gè)長(zhǎng)度為3369bp，編碼1122 aa，理論分子量大小為126kDa的開放式閱讀框。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)該序列與文獻(xiàn)已報(bào)道的海藻糖合成酶序列一致在29％-35％之間。該序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank Accession No: JQ951963)。該序列被命名為G526。
　　 隨后，我們以pET-32a為原核表達(dá)載體，構(gòu)建了

5、重組表達(dá)載體pET-32a-G526，并將該重組載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá)。經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，成功誘導(dǎo)出大量重組蛋白(rG526)。含有重組蛋白的菌體經(jīng)過(guò)超聲破碎、離心得到的上清液，用Ni柱進(jìn)行親和純化，純化后得到的蛋白經(jīng)蛋白電泳分析為單一條帶，大小為141 kDa(含親和標(biāo)簽)，與理論值一致。
　　 第二部分:rGS26重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究
　　 我們以麥芽糖和海藻糖為底物對(duì)rG526的酶學(xué)

6、性質(zhì)進(jìn)行研究。rG526能夠催化麥芽糖和海藻糖的相互轉(zhuǎn)化，反應(yīng)達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí)麥芽糖和海藻糖間的比例大約是7∶3。此外，該酶在催化麥芽糖生成海藻糖的過(guò)程中還生成一定量的葡萄糖（占總產(chǎn)物的5％）。經(jīng)過(guò)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相比海藻糖，rG526對(duì)麥芽糖具有較高的親和力和催化效率(Km/kcat)。rG526的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別是37℃和pH7.2。該酶在0℃-40℃溫育1h能保持85％以上活性，當(dāng)保溫溫度超過(guò)50℃，酶的活性只能保持

7、原來(lái)的10％。不同的金屬離子和抑制劑對(duì)酶的活性有一定的影響，其中Cu2+和SDS對(duì)酶的活性有顯著抑制作用。K+濃度對(duì)酶的活性有顯著影響，K+濃度在20-40mM時(shí)，rG526具有最高的催化活性。
　　 第三部分:rG526重要功能殘基鑒定與催化特性研究
　　 通過(guò)序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)G526的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)已知蛋白的海藻酮糖合成酶MutB(PDB:1_ ZJA)的氨基酸序列一致性較高（N端一致性達(dá)32％）。我們以MutB

8、的三維結(jié)構(gòu)作為模板，對(duì)G526進(jìn)行同源建模。同源建模結(jié)果顯示了G526中的一些殘基可能參與催化或與底物發(fā)生作用。通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，D78A、Y81A、H121A、D219A、E261A、H331A和D332A殘基的突變會(huì)使G526活性大幅降低。此外，我們還對(duì)rG526的催化特性進(jìn)行了研究。通過(guò)同位素底物標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二氘標(biāo)記的海藻糖和未標(biāo)記的海藻糖經(jīng)過(guò)酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生的是二氘標(biāo)記的二糖以及未標(biāo)記的二糖。另外，7個(gè)氘標(biāo)記的葡萄糖

9、不會(huì)在反應(yīng)過(guò)程中摻入到二糖中，說(shuō)明該酶的催化機(jī)制為分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基的反應(yīng)機(jī)制。
　　 結(jié)論:
　　 在本研究中我們從海洋假單胞菌中獲得了一新型的TreS。該TreS能夠催化麥芽糖和海藻糖之間的相互轉(zhuǎn)化并且其平衡點(diǎn)朝向生成海藻糖的方向，該結(jié)果表明該酶可能具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。在本研究中還找到一些可能參與催化或底物結(jié)合的重要?dú)埢?D78、Y81、H121、D219、E261、H331、D332A。這些氨基酸殘基可作為候選殘基進(jìn)一