海洋假單胞菌來源的新型海藻糖合成酶的基因克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原二糖廣泛存在于多種生物體內(nèi)。由于其性質(zhì)特殊,海藻糖在生物醫(yī)藥、食品、化妝品等多個領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用,但其市場應(yīng)用由于生產(chǎn)成本過高而受到限制。目前在生物體內(nèi)已經(jīng)鑒定了至少5條海藻糖合成酶途徑。在這5條途徑中,海藻糖合成酶(trehalose synthase,TreS)途徑是以低成本的麥芽糖為底物,通過轉(zhuǎn)糖基作用一步法生成海藻糖,具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
   海洋是一個復(fù)雜的生態(tài)大環(huán)境,具有高鹽、高壓、低溫

2、、缺氧等一系列復(fù)雜的特點,來源于海洋微生物的酶通常具有一些特殊的酶學(xué)性質(zhì)。此外,海藻糖能夠在極端環(huán)境下對微生物產(chǎn)生保護(hù)作用,海洋微生物為了能在海洋中生存需要產(chǎn)生較多的海藻糖來對抗環(huán)境壓力。因此,從海洋微生物中篩選具有潛在工業(yè)應(yīng)用價值的新型TreS是一個非常有用的途徑。
   目前,雖然已有多篇來源于不同物種的TreS的克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究的文獻(xiàn)報道,但還沒有一個關(guān)于海洋微生物來源的TreS的相關(guān)報道。在本研究中,通過篩選本課題組

3、的海洋微生物菌株庫,我們獲取了一個新型的海洋微生物來源的tres基因。我們將該tres基因在大腸桿菌中重組表達(dá)并將重組蛋白純化。此外,我們對該酶可能參與底物結(jié)合或催化的重要殘基進(jìn)行了鑒定,并對該酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉(zhuǎn)化過程中可能的機(jī)制也進(jìn)行了探討。
   第一部分:新型tres基因的獲取、克隆、表達(dá)及純化
   首先,從171株海洋微生物菌株中我們篩選到一個TreS高產(chǎn)菌株P(guān)8005。通過設(shè)計簡并引物與PCR擴(kuò)增,我

4、們獲得了一長648 bp的核心序列。隨后,通過TAIL-PCR,我們獲取了一個長度為3369bp,編碼1122 aa,理論分子量大小為126kDa的開放式閱讀框。通過氨基酸序列比對,我們發(fā)現(xiàn)該序列與文獻(xiàn)已報道的海藻糖合成酶序列一致在29%-35%之間。該序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(Genbank Accession No: JQ951963)。該序列被命名為G526。
   隨后,我們以pET-32a為原核表達(dá)載體,構(gòu)建了

5、重組表達(dá)載體pET-32a-G526,并將該重組載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá)。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后,成功誘導(dǎo)出大量重組蛋白(rG526)。含有重組蛋白的菌體經(jīng)過超聲破碎、離心得到的上清液,用Ni柱進(jìn)行親和純化,純化后得到的蛋白經(jīng)蛋白電泳分析為單一條帶,大小為141 kDa(含親和標(biāo)簽),與理論值一致。
   第二部分:rGS26重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究
   我們以麥芽糖和海藻糖為底物對rG526的酶學(xué)

6、性質(zhì)進(jìn)行研究。rG526能夠催化麥芽糖和海藻糖的相互轉(zhuǎn)化,反應(yīng)達(dá)到平衡點時麥芽糖和海藻糖間的比例大約是7∶3。此外,該酶在催化麥芽糖生成海藻糖的過程中還生成一定量的葡萄糖(占總產(chǎn)物的5%)。經(jīng)過動力學(xué)參數(shù)測定,發(fā)現(xiàn)相比海藻糖,rG526對麥芽糖具有較高的親和力和催化效率(Km/kcat)。rG526的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別是37℃和pH7.2。該酶在0℃-40℃溫育1h能保持85%以上活性,當(dāng)保溫溫度超過50℃,酶的活性只能保持

7、原來的10%。不同的金屬離子和抑制劑對酶的活性有一定的影響,其中Cu2+和SDS對酶的活性有顯著抑制作用。K+濃度對酶的活性有顯著影響,K+濃度在20-40mM時,rG526具有最高的催化活性。
   第三部分:rG526重要功能殘基鑒定與催化特性研究
   通過序列比對,我們發(fā)現(xiàn)G526的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)已知蛋白的海藻酮糖合成酶MutB(PDB:1_ ZJA)的氨基酸序列一致性較高(N端一致性達(dá)32%)。我們以MutB

8、的三維結(jié)構(gòu)作為模板,對G526進(jìn)行同源建模。同源建模結(jié)果顯示了G526中的一些殘基可能參與催化或與底物發(fā)生作用。通過定點突變實驗,我們發(fā)現(xiàn),D78A、Y81A、H121A、D219A、E261A、H331A和D332A殘基的突變會使G526活性大幅降低。此外,我們還對rG526的催化特性進(jìn)行了研究。通過同位素底物標(biāo)記實驗證實,二氘標(biāo)記的海藻糖和未標(biāo)記的海藻糖經(jīng)過酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生的是二氘標(biāo)記的二糖以及未標(biāo)記的二糖。另外,7個氘標(biāo)記的葡萄糖

9、不會在反應(yīng)過程中摻入到二糖中,說明該酶的催化機(jī)制為分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基的反應(yīng)機(jī)制。
   結(jié)論:
   在本研究中我們從海洋假單胞菌中獲得了一新型的TreS。該TreS能夠催化麥芽糖和海藻糖之間的相互轉(zhuǎn)化并且其平衡點朝向生成海藻糖的方向,該結(jié)果表明該酶可能具有潛在工業(yè)應(yīng)用價值。在本研究中還找到一些可能參與催化或底物結(jié)合的重要殘基:D78、Y81、H121、D219、E261、H331、D332A。這些氨基酸殘基可作為候選殘基進(jìn)一

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